【目的】利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)油体系统表达人成纤维细胞生长因子-21(Fibroblastgrowth factor-21,FGF21),为利用植物油体表达系统规模化生产FGF21奠定基础。【方法】以磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因作为转基因植物的安全筛选标记,将带有组氨酸标签的人源FGF21基因与大豆油体蛋白基因融合,克隆至大豆油体蛋白启动子驱动的表达载体pCAMBIA1390MDo(p1390MDo)上,构建植物双元表达载体p1390MDoFGF21。采用冻融法将植物双元表达载体p1390MDoFGF21转入农杆菌GV3101,花粉管导入法转化拟南芥,采用PC...

【目的】利用马铃薯X病毒(PVX)表达载体(pgR107),在本氏烟草中表达人成纤维细胞生长因子21(Fibroblast growth factor 21,FGF21),旨在寻求一种低成本、方便、安全,且保持hFGF21蛋白生物活性的方法。【方法】将包含组氨酸(His)标签序列的hFGF21-smGFP融合基因和hFGF21基因克隆进PVX表达载体,构建重组表达质粒pgR107-His-hFGF21-smGFP和pgR107-His-hFGF21。采用冻融法将质粒pgR107-His-hFGF21-smGFP、pgR107-smGFP和pgR107-His-hFGF21转入根瘤农杆菌GV31...

【目的】在番茄中表达人成纤维细胞生长因子-21(Fibroblast growth factor-21,FGF21),为利用植物反应器规模化生产FGF21奠定基础。【方法】以甘露糖-6-磷酸异构酶基因(pmi)作为转基因植物的选择标记,将人源fgf21基因克隆至表达载体pCAMBIA1390RⅡ(简写为p1390RⅡ)上,构建重组表达质粒p1390 RⅡMFGF21。采用冻融法将质粒p1390RⅡMFGF21转入根瘤农杆菌EHA105,叶盘法转化番茄(Lycopersicon esculentum)"中蔬6号",采用PCR检测、Southern杂交筛选转基因番茄阳性植株,并对FGF21蛋白在转...

以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为实验对象,利用RACE技术克隆了草鱼成纤维细胞成长因子8(Fibro-blast Growth Factor8,FGF8)cDNA序列。实验结果显示,草鱼FGF8 cDNA序列长度为887 bp,其中5′-非翻译区长100 bp,3′-非翻译区长157 bp,开放阅读框(ORF)633 bp,编码210个氨基酸的前体蛋白,包含22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。利用已知的FGF8序列绘制系统发育树,发现草鱼与两种鲤科鱼(班马鱼、墨西哥脂鲤)聚为一簇,显示亲缘关系很近,而与其它脊椎动物如两栖类、鸟类、哺乳类的亲缘关系则相对较远...

采用RT-PCR法对海兰鸡MyoD全长cDNA序列进行扩增,克隆、测序后,构建真核表达载体pEGFP-N1-MyoD,脂质体瞬时转染鸡胚成纤维细胞,用荧光显微镜、RT-PCR和SDS-PAGE电泳法检测MyoD蛋白表达情况。结果表明,构建的真核表达载体pEGFP-N1-MyoD能成功转染鸡胚成纤维细胞;荧光显微镜观察可见绿色荧光;RT-PCR可见目的条带;SDS-PAGE电泳证明表达的蛋白相对分子质量为33KD,该结果为研究MyoD蛋白的功能奠定了试验基础。

以陕北白绒山羊毛囊生长期皮肤组织cDNA为模板,扩增出Lhx2基因的CDS区,成功构建了以KAP6.1为启动子表达Lhx2基因的绿色荧光表达载体pIRES2-KAP-LHX-EGFP.并利用脂质体介导转染绒山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得了稳定转染的细胞系,经PCR检测显示外源基因已整合到细胞基因中.研究结果为进一步开展Lhx2基因对绒山羊毛囊发育的影响和转Lhx2基因绒山羊的生产提供了前期研究基础.

【目的】克隆徐淮山羊多能性转录因子0ct4、Sox2、K1f4和c—Myc的CDS片段,构建pMD19-T—oct4、pMD19-T—sox2、pMD19-T—k1f4和pMD19-T—c—myc重组质粒,随后构建含T7启动子的pcDNA3-oct4、pcDNA3-sox2、pcDNA3-k1f4和pcDNA3-c—myc重组质粒,通过体外转录,获得该4种多能性转录因子的mRNA,并使其在徐淮山羊成纤维细胞中稳定表达。【方法】应用RT—PCR方法分别从徐淮山羊睾丸组织、皮肤组织、小肠组织中扩增多能性转录因子Oct4、Sox2、K1f4和c—Myc基因编码全序列,将该4种基因分别克隆到pMD19...

为了构建敖汉细毛羊DKK1、BMP4基因真核表达载体及单、共转染成纤维细胞后研究两基因表达量之间的变化,以敖汉细毛羊为研究对象,采集40日龄的胎羊。首先,通过RNA的提取反转录成c DNA参照Gen Bank中DKK1、BMP4基因序列信息分别设计1对含有同源臂的引物,通过PCR反应扩增获得DKK1、BMP4基因片段、利用So So试剂盒将目的片段连接到pcDNA3. 1真核表达载体上。鉴定正确后的pcDNA3. 1-DKK1、pcDNA3. 1-BMP4重组质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;其次对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的pcDNA3. 1-DKK1、pcDNA3. 1-BMP4单、共转染成纤维细胞,利用荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测DKK1、BMP4基因单转染和共转染在成纤维细胞中表达量的变化。结果显示,经酶切、测序鉴定pcDNA3. 1-DKK1、pcDNA3. 1-BMP4构建成功,成纤维细胞原代、传代培养良好,转染后细胞生长良好,经实时荧光定量PCR技术和Western Blot检测DKK1基因共转染成纤维细胞较单转染的表达量极显著下降(P

采用半定量RT-PCR技术检测分析了在体外培养的猪成纤维细胞内分别添加终浓度为0.5,5,10,30μg/μL的维生素A后,分别作用12,24,48和72 h后,视黄酸受体γ基因(RARγ)的表达变化情况。结果表明,不同浓度组间差异不显著,但是分别作用24和72 h后,会出现抑制RARγ基因表达的现象。

【目的】证实小鼠胎儿成纤维细胞中钙调蛋白(calmodulin,CaM)基因参与热应激诱导型热休克蛋白70(Hsp70)的基因表达并明确其作用条件。【方法】取12.5 d孕鼠胚胎制备成纤维细胞(MEF),上述细胞随机分为对照组和热应激组:对照组在37℃条件下培养,热应激组包括Ⅰ组(39℃、0.5 h),Ⅱ组(39℃、1 h),Ⅲ组(39℃、1.5 h),Ⅳ组(41℃、0.5 h),Ⅴ组(41℃、1 h),Ⅵ组(41℃、1.5 h);每组3个重复。将选择的热应激组和对照组细胞分别加入不同浓度(25、50及100 mmol.L-1)钙调蛋白拮抗剂W7,运用RT-PCR检测Hsp70、CaM mRN...

旨在构建敖汉细毛羊BMP4基因的质粒及转染成纤维细胞后研究基因表达量的变化。以30日龄的敖汉细毛羊胚胎为研究对象。首先,通过RNA的提取反转录成cDNA参照GenBank中BMP4基因序列信息设计1对引物,通过PCR反应扩增获得BMP4基因片段、将得到的BMP4基因连接到pEASYTM-T1载体,构建pEASYTM-T1-BMP4重组质粒并转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建pcDNA3.1-BMP4重组质粒,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞;其次对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将重组pcDNA3.1-BMP4表达载体转染成纤维细胞,后检测BMP4基因在mRNA和蛋白水平上表达量的变化。结果显示:pcDNA3.1-BMP4构建成功后转染成纤维细胞BMP4基因的mRNA和蛋白表达量均显著上升,且转染组的表达量极显著地高于对照组(P<0.01)。成功构建了敖汉细毛羊BMP4基因的质粒,并且成功转染成纤维细胞,基因在细胞中过表达,结果可为进一步研究其功能奠定基础。

构建1株能够稳定表达FABP4的小尾寒羊成纤维细胞系,用于小尾寒羊未来的品种保护、开发与利用,首先利用组织块培养法制备了小尾寒羊原代成纤维细胞,然后利用全基因合成法克隆了绵羊FABP4基因,并构建了过表达FABP4的慢病毒载体。经过包装后,使用获得的慢病毒感染小尾寒羊原代成纤维细胞,并通过嘌呤霉素筛选稳定转染细胞,最后应用Western Blot鉴定FABP4蛋白的过表达水平。结果表明,经过传代23次后,得到纯度较高的小尾寒羊原代成纤维细胞。滴度测定表明,当在96孔板中添加病毒原液量为10(-4)μL时,

【目的】研究粒细胞集落刺激因子(granule cell stimulating factor,GCSF)在羊成纤维细胞体外培养中对其增殖、周期和凋亡的影响,为今后基于羊GCSF为靶标诱导全能干细胞进行分子遗传育种研究提供理论依据。【方法】将羊GCSF真核表达质粒pRTL1-GCSF和对照载体质粒pRTL1分别转染到1×10~5个细胞/mL的羊成纤维细胞中,培养48 h后,利用Trizol法分别提取总RNA并反转录为cDNA,通过实时荧光定量PCR检测羊GCSF在羊成纤维细胞中的瞬时表达水平。通过GCSF依赖型细胞系NFS-60,利用细胞活力检测试剂alamarBlue测定转染48 h后羊成纤维细胞培养上清中分泌表达的GCSF的生物学活性。通过HEK 293F悬浮培养细胞系真核表达分泌型羊GCSF蛋白后,用Ni-NTA凝胶对细胞表达至细胞培养基中的GCSF蛋白进行纯化,并SDS-PAGE检测。加入纯化的30 ng·mL~(-1) GCSF蛋白后在24和48 h时,通过alamarBlue测定羊成纤维细胞的增殖状态,利用流式细胞术检测羊成纤维细胞的细胞周期和凋亡变化。【结果】羊GCSF真核表达质粒转染羊成纤维细胞48 h,检测发现在羊成纤维细胞中GCSF表达量得到显著提高。在羊成纤维细胞中,转染了pRTL1-GCSF质粒的羊GCSF表达量是转染了pRTL1空载对照组的(50 615.92±4 738.83)倍(P<0.01);羊成纤维细胞瞬时分泌表达的含有GCSF蛋白的培养基上清加入到GCSF依赖型细胞系NFS-60后,试验组和阳性对照组中的NFS-60的荧光强度与阴性对照组和空白对照组相比显著升高(P0.05),结果显示羊GCSF能显著刺激NFS-60细胞的增殖,表明在羊成纤维细胞中表达的羊GCSF具有生物学活性。用HEK 293F悬浮培养细胞系真核表达分泌型羊GCSF蛋白后,纯化得到羊GCSF蛋白。在羊成纤维细胞中添加30 ng·mL-1的羊GCSF后,体外培养24和48 h,GCSF试验组与培养基稀释液对照组相比,细胞活力变化差异不显著,而细胞周期的分布出现显著改变。24 h时,与对照组相比试验组的G1期细胞比例由(55.29±1.68)%增加到(69.37±0.24)%,差异极显著(P0.05);G2/M期细胞显著增多(P<0.01);S期细胞比例由(13.45±1.33)%增加为(37.87±2.43)%,差异极显著(P0.05)。表明加入GCSF的羊成纤维细胞在48 h时,处于间期的细胞显著减少,同时DNA复制状态的细胞显著增多。试验组凋亡率和对照组相比,培养24 h时对照组(Ctr)和试验组(GCSF)的凋亡率分别是(7.51±0.38)%和(9.16±0.46)%。48 h时对照组和试验组的凋亡率分别是(5.73±0.29)%和(5.39±0.27)%。72 h时对照组(Ctr)和试验组(GCSF)的凋亡率分别是(8.88±0.45)%和(5.41±0.27)%,24 h和72 h凋亡率差异极显著(P0.05),表明在GCSF添加的24 h内促进了细胞凋亡,随着时间的延长,细胞的凋亡受到抑制。【结论】羊成纤维细胞中可以瞬时过量表达羊GCSF,并具有生物学活性。GCSF不影响羊成纤维细胞的增殖,但可调控其周期,影响细胞凋亡。该结果为今后通过羊成纤维细胞介导GCSF培育具有高免疫力、高抗病性的羊进行分子遗传育种奠定了基础。

【目的】构建绒山羊血管内皮生长因子164(vascular endothelial growth factor 164,VEGF164)基因的毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞,筛选获得稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】以pCDsRed2载体为基本骨架将VEGF164基因亚克隆到KAP6-1启动子下游,接续连接红色荧光蛋白表达元件,构建VEGF164基因毛囊特异表达载体pCDsRed2-KV(6.3 kb)。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基...

为了研究拟南芥CPK10发挥功能的分子机理,通过PCR扩增克隆了CPK10基因,将该基因连接到带有FLAG和HA标签的双元串联亲和层析载体上,构建成p CM1307-3FLAG-3HA-CPK10植物表达载体,进而通过PEG介导转化拟南芥野生型原生质体,表达约10 h,通过Western Blotting检测融合有FLAG和HA标签的CPK10蛋白的表达情况,结果显示,可以分别利用FLAG抗体和HA抗体特异检测到CPK10蛋白的条带。融合蛋白的成功表达,为进一步通过串联亲和纯化技术(TAP)筛选CPK10的互作蛋白奠定基础。