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[期刊] 中国农业科学
[作者]
韩雪洁 萨日娜 梁浩 李雪玲 李荣凤
【目的】人凝血因子Ⅸ(human coagulation factorⅨ,hFIX)是凝血过程中的关键因子,对临床治疗血友病有着极其重要的意义。研究旨在构建人凝血因子Ⅸ乳腺表达载体,在猪乳腺上皮细胞中验证其乳腺特异表达能力,获得hFIX转基因雌性乳腺上皮细胞和猪胎儿成纤维细胞,为克隆乳腺特异表达人凝血因子Ⅸ的转基因猪做准备。【方法】按照TaKaRa公司RNAiso Reagent和Prime Script RT-PCR试剂盒的说明书,从人胎儿肝脏中提取RNA并扩增出人凝血因子Ⅸ(human coagulation factorⅨ,hFIX)cDNA序列,利用PCR方法扩增牛生长激素(BGH)p...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张晶晶 刘凤军 彭淑英 宋红卫 张涌
构建了携带人乳铁蛋白(LTF)基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因的乳腺特异性表达载体(pEBL),用脂质体法转染泌乳期莎能奶山羊乳腺上皮细胞,转染后于荧光显微镜下观察GFP表达情况。用G 418对转染细胞进行筛选,获得抗性细胞克隆,并对转染细胞进行PCR检测。结果显示,pEBL构建成功,转染6 h后可观察到细胞有GFP表达,PCR检测阳性克隆细胞转有LTF基因。表明pEBL载体已转染山羊乳腺上皮细胞,为进一步建立转基因动物乳腺生物反应器奠定了基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
顾玲 王强 郑月茂 安志兴 马利兵 张涌
为进一步研究基因疫苗的免疫机制与免疫效果,探讨外源基因在乳腺中的定位表达,应用重组PCR方法,将猪瘟病毒(CSFV)E2基因与牛β-乳球蛋白(BLG)5′部分调控序列连接起来,并插入到真核表达载体pEGFP-C1上,构建了含有CSFVE2基因的乳腺特异表达载体。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
曹随忠 姚学萍 崔亚飞 杨德英 雍康 余树民 刘宗平
【目的】构建奶牛气管抗菌肽(TAP)基因乳腺特异性表达载体。【方法】根据GenBank中牛TAP基因cDNA序列(GenBank号:NM_174776)设计引物,从奶牛乳腺组织中RT-PCR扩增TAP基因编码序列,将其克隆到pMD19-T(simple)载体中测序。重组质粒pMD-TAP经EcoRⅠ+KpnⅠ双酶切回收目的基因片段,亚克隆到携带增强型绿色荧光蛋白的通用型乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP中,采用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞(bMEC)、COS-7细胞,并注射泌乳家兔乳腺组织,荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达,半定量RT-PCR检测家兔乳腺组织中TAP mRNA的表达...
[期刊] 华北农学报
[作者]
于文慧 展西振 丰艳妮 曹荣峰 姜忠玲 李华涛 田文儒
为了构建HSP72慢病毒表达载体,建立稳定表达HSP72的牛乳腺上皮细胞系。以牛HSP72基因序列为模板,设计并合成引物,PCR扩增目的基因,连接到慢病毒表达质粒中,用包装获得的慢病毒感染牛乳腺上皮细胞,经一定浓度的嘌呤霉素筛选,Hochest33342法对细胞核定位,倒置荧光显微镜下观察转染效率,用免疫组化和Western Blot方法验证感染细胞是否稳定表达HSP72。结果显示,携带HSP72基因的慢病毒滴度约为1. 0×109TU/m L;确定嘌呤霉素的最佳筛选浓度为2μg/m L;牛HSP72慢病毒感染细胞表达HSP72,感染的奶牛乳腺上皮细胞在倒置荧光显微镜下可看到绿色荧光,转染效率可达90%以上;免疫组化结果表明,正常细胞和空载体感染细胞,HSP72呈现低表达,转染携带HSP72目的基因载体细胞,HSP72高表达,呈现颜色较深的棕色; Western Blot方法检测证实与正常转染细胞相比,慢病毒空载体转染的奶牛乳腺上皮细胞HSP72表达稍有降低,但无统计学差异,而携带HSP72基因的慢病毒载体转染的细胞HSP72呈现高表达,且差异极显著(P
[期刊] 中国农业科学
[作者]
鲍文蕾 李彬 侯鑫 刘俊娥 郭旭东 王志钢 刘东军
【目的】构建绒山羊血管内皮生长因子164(vascular endothelial growth factor 164,VEGF164)基因的毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞,筛选获得稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】以pCDsRed2载体为基本骨架将VEGF164基因亚克隆到KAP6-1启动子下游,接续连接红色荧光蛋白表达元件,构建VEGF164基因毛囊特异表达载体pCDsRed2-KV(6.3 kb)。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
白丁平 陈静 谢璐娜 刘敏 陈玉林
以陕北白绒山羊毛囊生长期皮肤组织cDNA为模板,扩增出Lhx2基因的CDS区,成功构建了以KAP6.1为启动子表达Lhx2基因的绿色荧光表达载体pIRES2-KAP-LHX-EGFP.并利用脂质体介导转染绒山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得了稳定转染的细胞系,经PCR检测显示外源基因已整合到细胞基因中.研究结果为进一步开展Lhx2基因对绒山羊毛囊发育的影响和转Lhx2基因绒山羊的生产提供了前期研究基础.
[期刊] 华北农学报
[作者]
张梦瑶 杨峰 刘开东 刘积凤 贺建宁 柳楠
为了构建敖汉细毛羊DKK1、BMP4基因真核表达载体及单、共转染成纤维细胞后研究两基因表达量之间的变化,以敖汉细毛羊为研究对象,采集40日龄的胎羊。首先,通过RNA的提取反转录成c DNA参照Gen Bank中DKK1、BMP4基因序列信息分别设计1对含有同源臂的引物,通过PCR反应扩增获得DKK1、BMP4基因片段、利用So So试剂盒将目的片段连接到pcDNA3. 1真核表达载体上。鉴定正确后的pcDNA3. 1-DKK1、pcDNA3. 1-BMP4重组质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;其次对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的pcDNA3. 1-DKK1、pcDNA3. 1-BMP4单、共转染成纤维细胞,利用荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测DKK1、BMP4基因单转染和共转染在成纤维细胞中表达量的变化。结果显示,经酶切、测序鉴定pcDNA3. 1-DKK1、pcDNA3. 1-BMP4构建成功,成纤维细胞原代、传代培养良好,转染后细胞生长良好,经实时荧光定量PCR技术和Western Blot检测DKK1基因共转染成纤维细胞较单转染的表达量极显著下降(P
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
杨海 王芳宇 李青旺 胡建宏 董潇潇 单永红
【目的】建立一种对人抗凝血酶(AT)Cys248位点进行定点突变和真核表达的可靠方法,为突变体的结构和功能研究提供原始材料。【方法】以人AT cDNA序列为模板,设计1对反向扩增引物,进行反向PCR反应;PCR产物经连接、测序后,克隆至表达质粒pcDNA3.1(+)-GFP上,构建重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-mATGFP;用重组载体介导突变基因在山羊乳腺上皮(GME)细胞内表达,收集细胞培养上清液进行表达产物的定性、定量检测。【结果】突变基因经测序证实与预期结果一致,且在GME细胞内得到高效表达,细胞培养液上清中的突变体质量浓度为(526±17.3)mg/L。【结论】反向PCR法是...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
毕聪明 张仕强 彭树英 吕宁 张涌
为了构建端粒酶逆转录酶表达载体,用带有绿色荧光蛋白报告基因的载体pEGFP-C1和带有hTERT cDNA的载体pCL-Neo-hTERT,通过基因重组构建新的载体pEGFP-hTERT,转化后筛选阳性克隆进行酶切鉴定;pEGFP-hTERT载体通过脂质体介导法转染纯化后的牛A型精原细胞,观察绿色荧光表达,G418筛选阳性克隆。结果表明,pEGFP-hTERT载体与预设计的一致;pEGFP-hTERT载体转染牛A型精原细胞后,经筛选获得了1个表达绿色荧光蛋白的阳性细胞克隆。由此可见,hTERT表达载体得到了成功构建,并在牛A型精原细胞中实现了表达。
关键词：
A型精原细胞 基因重组 hTERT 牛
[期刊] 中国农业科学
[作者]
徐丹丹 王建发 张旭 刘东宇 许小楠 王乐 陈嘉 单旭菲 王晓雅 武瑞 杨彬
【目的】奶牛乳房炎是奶牛养殖业中最为常见,同时也是带来经济损失最为严重的疾病之一,其主要病因是细菌感染。奶牛乳腺的固有免疫是抵抗病原菌入侵的第一道防线。NOD2是机体固有免疫模式识别受体核苷酸结合寡聚域(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)蛋白家族中的重要一员,通过识别其特异性配体胞壁酰二肽(muramyl dipeptide,MDP)——一种广泛存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁中的成分,而参与抵抗多种病原菌入侵。奶牛乳腺上皮细胞(bovine
关键词：
奶牛乳腺上皮细胞 MDP NOD2
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
狄和双 杨媛媛 王利刚 崔群维 程凯宁 黄静燕 王根林
应用乳酸脱氢酶(LDH)活力测定、透射电镜、免疫组化和Caspase-3活性分析等技术,检测转化生长因子β1(TGF-β1)对奶牛乳腺组织细胞活性、凋亡和HSP70蛋白表达的影响。用10 ng.mL-1TGF-β1处理乳腺组织48 h,分别在不同时间点收集组织和培养液检测各指标,以0 h不加TGF-β1作为对照组。结果显示,随TGF-β1作用时间的延长组织细胞活率逐渐降低,24 h和48 h组显著低于对照组(P
[期刊] 西南农业学报
[作者]
陈克贵 王海燕 张义正
根据已知的甘薯块根贮藏蛋白基因序列, 设计和合成了两对PCR引物。用PCR方法,从南薯88基因组中分别扩增出两种DNA片段: 一种含有贮藏蛋白基因启动子和核糖体结合序列(SP2);第二种不仅含有第一种DNA片段的全部序列,而且还有贮藏蛋白的信号肽编码序列(SP1)。核苷酸序列分析表明,这两种DNA片段的启动子和核糖体结合区虽然具有很高的同源性(82% ), 但它们并不相同。在SP1和SP2 的基因启动子区都存在几种典型的保守序列, 如受糖诱导调控的蔗糖盒(Suc-box),CAAT盒和TATA盒。用这两种DNA片段分别构建了可调控的甘薯高效表达载体。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
付永平 张君 王丕武 周海涛 曲静
【目的】构建具有大豆蛋白酶抑制剂BBi基因反向重复结构的ihpRNA种子特异性表达载体,并将其转入根癌农杆菌中,为大豆品质改良奠定基础。【方法】采用PCR技术克隆大豆蛋白酶抑制剂BBi基因的正义和反义片段、大豆种子特异性启动子7αP和作为内含子的GFP基因片段,分别连入克隆载体pMD18-T Vector中。然后根据植物中ihpRNA原理,以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,将组成RNAi载体的4个目的片段分别连入其中,然后利用冻融法转化根癌农杆菌,并进行PCR鉴定。【结果】PCR扩增得到组成RNAi载体的4个目的片段,分别构建成重组克隆载体和ihpRNA种子特异性表达载体p7αP-G...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘超 于萌 朱海鲸 李明昭 华进联
【目的】用两种方法构建miR-34c的慢病毒表达载体,并包装成慢病毒颗粒,为经济、高效的进行miR-34c超表达提供方案,为进一步研究miR-34c的作用奠定基础。【方法】从小鼠基因组中扩增miR-34c前体,分别插入pLL3.7的CMV启动子起始的GFP之后或U6启动子后,构建成载体pLL3.7-CMV-34c及pLL3.7-U6-34c。将重组慢病毒载体和包装质粒混合物转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,测定病毒滴度。感染293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞,用293T细胞与奶山羊雄性生殖干细胞的GFP表达程度测定转染效率,用定量PCR方法测定miR-34c的表达效率。【结果】...
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