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[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
刘永生 唐江山 路伟 陈豪泰 孙德惠 才学鹏 张杰
叠朊(Dpl)是朊蛋白(PrP)的横向同源物,两者的功能密切相关。本研究旨在制备能够特异检测重组表达的或者动物组织中Dpl的抗血清,以用于研究Dpl的功能及其与PrP的关系。根据已克隆的汉族人、中国黄牛、甘肃土种羊的Dpl基因,将其Dpl成熟蛋白编码区分别定向克隆到表达载体pET-30a(+)上,将重组表达载体转入E.coliBL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达。将表达并纯化的牛重组Dpl免疫4只青紫蓝兔,制备牛Dpl的抗血清,SDS-PAGE分析表明人、牛和羊的重组Dpl在E.coli中获得了高效表达。用Ni-NTA树脂亲和层析和胶洗脱法纯化了上述表达产物,ELISA和West-b...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
袁志栋 王志亮 刘雨田 吴晓东 赵永刚 刘海生
目的克隆、分析水牛朊蛋白(prionprotein,PrP)成熟片段基因,并获取纯化的表达产物。方法将应用PCR技术扩增的水牛成熟PrP的核酸序列克隆到表达载体pET-32a,并分析其序列;把阳性克隆质粒pET-32a-BPrP转化表达菌BL21(DE3),鉴定纯化的表达产物。结果水牛朊蛋白成熟片段核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其他牛科动物的成熟PrP核酸、氨基酸序列间的相似性分别在97.1%和97.2%以上,并且发现水牛成熟PrP有5个重复序列,编码的氨基酸序列其中有2个九肽和3个八肽重复序列。具有较高的表达水平的PrP融合蛋白被纯化后,用Western印迹实验证明该蛋白具有PrP抗原活...
关键词：
水牛成熟PrP 克隆 序列分析 原核表达
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
江彤 杨友志 丁菲 蒋磊 李祥宇 邓竹根 谢朝阳 宋培培
PCR扩增得到了草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)的外壳蛋白(coat protein,cp)基因,将SVBV cp基因克隆到原核表达载体pET-32a上,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用终浓度为0.05 mmol·L-1的IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳及Western-blot分析表明,SVBV cp基因在大肠杆菌中得到了融合表达。利用Ni2+-NTA亲和树脂纯化重组融合蛋白,免疫家兔获得了重组蛋白的多抗血清。以此多抗血清建立了Dot-ELISA检测方法,结果表明,制备的特异性多抗血清可以快速检测出感病草莓样品中的SVBV。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
郑宽瑜 董家红 尹跃艳 方琦 苏晓霞 张仲凯
用ＲＴ－ＰＣＲ从感染番茄环纹斑点病毒（ＴｏｍａＴｏ ｚｏｎａＴｅ ｓＰｏＴ ｖｉＲｕｓ，Ｔｚｓｖ）的番茄中扩增出编码病毒非结构蛋白ｎｓｓ基因，将ｎｓｓ基因构建到原核表达载体Ｐ ｅＴ－３０ ａ中，获得原核表达载体Ｐ ｅＴ－３０ａ－ｎｓｓ，转化大肠杆菌ＢＬ２１（Ｄｅ３），用ｉＰＴＧ诱导表达。ｓＤｓＰａＧｅ电泳分析显示，高效诱导表达了５７ｋ Ｄａ融合蛋白。用回收纯化的融合蛋白免疫家兔，获得多抗血清。间接ｅＬｉｓａ测定多抗血清的效价为１／８１９２。用制备好的抗血清对Ｔｚｓｖ感病病样进行ＷｅｓＴｅＲｎ ＢＬｏＴＴｉｎＧ检测，能检测到特异性条带。结果表明该抗血清可用于Ｔｚｓｖ的检测，并为进一步研究ｎｓｓ功．．．
[期刊] 水产学报
[作者]
余振兴 朱倩 姚翠鸾
LC3B是检测自噬程度的标志性分子,但是在低等动物体内缺少特异性强的LC3B抗体。为研究贝类的自噬性细胞死亡,本研究通过将紫贻贝的LC3B编码序列克隆到pET-32a原核表达载体中构建重组表达载体,进而对IPTG诱导浓度、诱导表达时间进行摸索;采用亲和层析对重组蛋白进行纯化,并采用SDS-PAGE检测及Western blot进行验证;利用获得的重组蛋白免疫新西兰兔,制备其多克隆抗体。结果显示,在20℃,转速为150 r/min条件下,当IPTG浓度为0.6 mmol/L,诱导表达10 h后,可以得到高表
[期刊] 西南农业学报
[作者]
郑宽瑜 董家红 尹跃艳 方琦 苏晓霞 张仲凯
用RT-PCR从感染番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,TZSV)的番茄中扩增出编码病毒非结构蛋白NSs基因,将NSs基因构建到原核表达载体p ET-30 a中,获得原核表达载体p ET-30a-NSs,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDSPAGE电泳分析显示,高效诱导表达了57k Da融合蛋白。用回收纯化的融合蛋白免疫家兔,获得多抗血清。间接ELISA测定多抗血清的效价为1/8192。用制备好的抗血清对TZSV感病病样进行Western blotting检测,能检测到特异性条带。结果表明该抗血清可用于TZSV的检测,并为进一步研究NSs功...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张蔚明 刘燕娟 周倩 廖晓兰
南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)p10蛋白由其基因组片段S10编码,根据SRBSD海南分离物S10序列(EU523360)设计特异性引物扩增编码p10蛋白的片段,并亚克隆至原核表达载体pET-28a+,以大肠杆菌BL21plysS为宿主菌进行高水平表达,利用纯化的p10蛋白免疫兔子,制备了p10蛋白的特异性抗血清。ELISA检测显示,p10蛋白的抗血清可与来自湖南不同地区的白背飞虱病汁液发生强烈的血清学反应,表明该抗血清适用于田间SRBSDV的快速诊断。
关键词：
南方水稻黑条矮缩病毒 原核表达 抗血清
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王学斌 俞慧清 吴晓东 徐旭俊 陈建泉 成国祥
【目的】利用朊蛋白双基因敲除(PRNP-/-)羊制备朊蛋白多克隆抗体,并对其特性进行分析。【方法】构建山羊朊蛋白(PrP)原核表达载体,转入大肠杆菌并诱导表达,纯化获得羊PrP;将获得的PrP免疫PRNP-/-山羊,制备朊蛋白特异性的多克隆抗体;并对获得的朊蛋白多克隆抗体进行ELISA及Western-blot检测。【结果】获得了大量的朊蛋白特异性抗血清,间接ELASA检测抗血清中朊蛋白多克隆抗体的效价为25600;Western-blot检测显示所制备抗体不仅可以识别鼠、牛、羊脑组织内源性朊蛋白,而且能识别鼠脑组织内朊病毒。【结论】PRNP-/-转基因山羊可用于制备大量高亲和力朊蛋白多克隆抗...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
何丹妮 周斌 张小敏 陈溥言 庞然 赵津
利用1对特异性引物,从pT-poMx1中扩增出Mx1基因开放式阅读框(1 992 bp),并将其编码区插入到携带GST标签的原核表达载体pGEX-6p-1中,经酶切和序列测定后,重组质粒pGEX-poMx1转化入大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导表达融合蛋白并分析表达效果。结果表明:经终浓度为0.8 mmol.L-1 IPTG诱导后4 h,猪源Mx1基因(poMx1)在BL21(DE3)中获得高效表达,表达量占菌体蛋白的32.6%,SDS-PAGE显示融合蛋白相对分子质量为99×103。将目的蛋白切胶后免疫Balb/c小鼠,制备了特异性多抗血清,Western blot结果显示该抗血...
关键词：
猪源Mx1基因 原核表达 抗血清
[期刊] 华北农学报
[作者]
王芳 汤璧蔚 董乐 刘宝 黄慧 黄苹苹 张立群 栾芙蓉
为探讨蓖麻肌动蛋白(Actin)基因(RcActin)是否可作为蓖麻基因表达研究中的内参基因。以蓖麻生长根为试验材料,根据GenBank中公布的RcActin全长cDNA序列(登录号:XM_002522148.3)设计合成特异性引物,经PCR扩增获得RcActin的编码序列(CDS),并将其插入原核表达载体pET32a(+)中。重组表达载体pET32a(+)-RcActin转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合6个组氨酸标签的目的蛋白,表达蛋白经钴离子螯合磁珠纯化后,采用Western Blot验证,结果表明,pET32a(+)-RcActin可诱导表达分子量约为61.46 ku的融合蛋白His-RcActin。用纯化的His-RcActin免疫BALB/c小鼠,经细胞融合及筛选获得9株能分泌抗蓖麻RcActin蛋白质单克隆抗体(Monoclonal antibody, McAb)的杂交瘤细胞株。利用阳性杂交瘤细胞株刺激小鼠,取腹水,采用间接ELISA方法测定,结果表明,5株阳性单克隆细胞株腹水效价达到1∶1 000 000及以上。用蛋白A/G亲和层析法纯化His-RcActin McAb;采用间接ELISA方法对纯化McAb的特异性进行测定,3株阳性细胞株能分泌针对RcActin的特异性McAb;通过抗体亚类鉴定试剂盒鉴定纯化McAb的亚型,结果表明,3株阳性细胞株分泌的McAb亚类均为IgG1。采用间接ELISA方法对3株阳性细胞株分泌McAb的稳定性进行鉴定,获得1株在体外传19代或液氮冻存4个月后、能稳定分泌McAb的阳性细胞株。采用Western Blot和间接ELISA方法对从该细胞株中纯化的McAb的特异性、效价进行验证,结果表明,获得的McAb具有针对RcActin的特异性且效价为1∶512 000。以制备的McAb为一抗,利用Western Blot方法分析RcActin在正常水肥管理且时空一致条件下的蓖麻8个组织中的表达量,结果表明,蓖麻不同组织中RcActin的含量存在显著性差异(P<0.05)。RcActin表达研究为蓖麻功能基因表达分析中内参基因的筛选提供了一定的理论依据。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
陈继明 龚晓明 陆承平 韩正康
将β２激动剂克伦特罗（ＣＬ）偶氮化后分别连接牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、兔血清白蛋白（ＲＳＡ）和兔ＩｇＧ（ＲＧＧ），分别用上述连接物免疫３组新西兰兔。经琼脂扩散试验、间接ＥＬＩＳＡ和间接抑制ＥＬＩＳＡ检测表明，ＢＳＡ、ＲＳＡ和ＲＧＧ均能作为载体制备ＣＬ抗血清。ＢＳＡ作为载体制备的抗血清含有大量针对载体的抗体，而ＲＳＡ和ＲＧＧ作为载体制备的抗血清不含有针对载体的抗体，显示自身蛋白可作为载体，且优于异源蛋白。
关键词：
克伦特罗 载体 兔 抗体
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
宋希云 高文淑 吕冬 黄铁城 刘广田
本文利用纯化的小麦胚乳贮藏蛋白高分子量谷蛋白亚基（HMW－GS）为抗原制备了8个不同的兔抗血清，并对这些抗血清与不同品种小麦贮藏蛋白的免疫化学反应进行了研究，结果表明：HMW－GS具有较好的免疫原性，能够产生较高效价的抗血清；HMW－GS抗血清与小麦胚乳全谷蛋白具有较强的反应，但与醇溶蛋白反应较弱；HMW－GS抗血清可用于小麦品质性状的测定，但不能有效地鉴别不同的HMW－GS。
关键词：
抗血清 高分子量谷蛋白亚基 小麦
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
马跃 王建珏 黄江涛 张天颖 史怀平
【目的】原核表达奶山羊表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)蛋白胞外区25-644位共620个氨基酸序列(ECD序列),纯化蛋白并免疫家兔,制备针对山羊EGFR蛋白的特异性多克隆抗体,为山羊EGFR蛋白功能研究奠定基础。【方法】以pMD19-T-EGFR为模板,采用PCR方法扩增得到EGFR胞外区(ECD)基因序列。将ECD序列连接pET-32a(+)质粒构建pET-32a(+)-ECD原核表达载体,将该重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导
[期刊] 水产学报
[作者]
赵景壮 徐黎明 刘淼 曹永生 尹家胜 刘红柏 卢彤岩
为了能够成功表达虹鳟IgM,本研究利用生物信息学软件对虹鳟IgM的亲水性及抗原性进行了分析,根据GenBank收录的虹鳟IgM重链恒定区,参照生物信息学分析结果,设计用于扩增截短的IgM基因的引物,以虹鳟头肾RNA提取物为模板,利用RT-PCR方法扩增虹鳟截短的IgM重链恒定区部分基因片段,连接原核表达载体pET-27b,利用大肠杆菌Rosetta进行表达。SDS-PAGE及HPLC结果显示,纯化后截短的IgM大小约为47.7 ku,且纯度达到90%。利用其制备兔抗血清后ELISA分析结果显示,所制备的兔抗血清与本研究所表达的截短IgM蛋白的反应效价为1∶40 000,与虹鳟血清提取的全长Ig...
关键词：
虹鳟 IgM 基因克隆 抗血清
[期刊] 华北农学报
[作者]
吴洪波 刘刚 张路路 王冬梅
提取小麦品种L10的总RNA,进行反转录,其产物用于探究自噬基因ATG8的生物学功能。用PCR方法克隆ATG8,将克隆的ATG8亚克隆至表达载体PMD19-T,酶切后切胶回收,然后把产物测序鉴定,转化宿主菌E.coliRosetta-gami B(DE3),构建原核表达系统,将融合蛋白纯化后制备其兔抗血清,然后利用Western Blotting技术对兔抗血清进行检测,鉴定了该抗血清的结合特异性。ATG8抗体的成功制备,为小麦中ATG8基因和自噬功能的研究奠定了基础。
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