【目的】建立产气荚膜梭菌β毒素抗体间接ＥＬＩＳＡ检测方法。【方法】将原核表达重组质粒ｐＥＴ－２８Ａ－β转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞，用ＩｐＴＧ进行诱导表达，表达产物经镍柱亲和层析纯化、尿素梯度透析复性后进行ＷＥＳＴＥｒｎ ＢＬｏＴ鉴定。用复性的β毒素重组蛋白作为包被抗原，通过优化间接ＥＬＩＳＡ试验条件，建立其抗体间接ＥＬＩＳＡ检测方法，对该方法的特异性、敏感性和重复性进行考察，并用其对５２１份临床样本进行检测。【结果】通过诱导、纯化和复性，获得了纯度较高且具有良好反应原性的β毒素重组蛋白。间接ＥＬＩＳＡ条件为：抗原最佳包被质量浓度为５．０μＧ／ｍＬ，阳／阴性血清最佳稀释度为１∶５０．．．

为了探索一种快速、准确检测产气荚膜梭菌毒素型的方法,以便有效预防控制该病的流行和发生,利用SDS-PAGE方法,对通过ELISA鉴定的20株(A型16株、C型3株和D型1株)德国牛舍环境气源性产气荚膜梭菌分离株,以及通过Multiplex-PCR鉴定的57株山东省疫区产气荚膜梭菌分离株外毒素蛋白的相对分子质量进行测定,以确定毒素的种类,进而确定菌株的毒素型。结果表明,产气荚膜梭菌标准株、德国牛舍环境气源性产气荚膜梭菌分离株、山东省疫区产气荚膜梭菌分离株粗提外毒素的质量浓度分别为3.261,2.238~3.333,1.451~3.109mg/mL,精提外毒素的质量浓度分别为0.803,0.521...

用细菌学方法分离并初步鉴定文蛤内脏中的产气荚膜梭菌,PCR方法检测分离菌株的α、β、ε、ι、β2和肠毒素等产气荚膜梭菌毒素基因,PCR扩增片段克隆后进行核苷酸序列测定,然后与GenBank相应毒素基因的核苷酸序列进行同源性比较;分离菌株α毒素全长基因克隆、测序后与不同来源分离株进行同源性比较;检测内脏产气荚膜梭菌阳性的蛤肉组织中的α毒素基因以判定食品安全性。结果表明,文蛤内脏产气荚膜梭菌分离率为71%,69%的分离菌株为C型,31%的为A型,两种毒素型均能扩增出特异性β2条带及肠毒素条带,检出基因与GenBank相应毒素基因的同源性在98%以上;蛤肉组织α毒素基因检测结果为阴性。文蛤内脏分离菌...

本研究旨在研制一种以紧密素为检测靶标的间接ＥＬＩＳＡ技术，检测血清中产志贺毒素大肠杆菌（ＳｈＩｇＡ ｔｏｘＩｇＥｎＩｃ ＥＳｃｈＥｒＩｃｈＩＡ ｃｏＬＩ，ＳｔＥｃ）的抗体水平。根据紧密素２７个亚型的ｎ端保守序列，体外表达３９０～５４３ ＡＡ片段制备包被抗原，通过敏感性、特异性、重复性和稳定性实验，建立检测ＳｔＥｃ的抗体的间接ＥＩＩＳＡ方法。经优化筛选的间接ＥＬＩＳＡ最佳反应条件：抗原包被浓度３ ｎｇ／孔，待检血清稀释比例１∶２００，ｈｒＰ－兔抗羊Ｉｇ ｇ、ｈｒＰ－兔抗牛Ｉｇ ｇ的工作浓度均为１∶１５０００，５％脱脂奶封闭Ｌ ｈ，底物作用时间１０ｍＩｎ，用于牛、羊疫苗抗体检测或者ＳｔＥｃ大肠杆菌．．．

鸭圆环病毒(DuCV)是新发现的一种感染鸭的最小病毒,可导致鸭淋巴组织损伤。目前尚无检测其抗体的商品化ELISA试剂盒。为了对鸭群进行DuCV血清流行病学调查,本试验用原核表达了全长DuCV Cap蛋白,Western blot检测证明表达产物具有良好的抗原性。以纯化的重组Cap蛋白作为包被抗原,应用30份DuCV抗体阴性血清和16份DuCV抗体阳性血清,建立了检测DuCV抗体的间接ELISA方法,以此方法对从江苏地区收集的部分鸭血清样品进行检测,结果显示DuCV抗体阳性率为26.7%(38/142)。试验证明该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,且方法的变异系数均小于10%。结论:该方法操...

建立了检测猪圆环病毒2型血清抗体的间接ELISA方法,并初步应用于临床血清样品的检测。用PCR方法从PCV2 HBZX株中获得截短的核衣壳(capsid,Cap)基因,将该基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-Cap,将该重组质粒转化宿主菌E.coliBL21-CodonPlus(DE3),用IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot鉴定蛋白的正确表达,表达蛋白Cap分子质量为42 ku,可与6×HIS抗体反应;KCl预染切胶纯化目的蛋白,以其为抗原建立检测PCV2感染猪血清抗体的间接ELISA方法。ELISA检测5份血清样品结果变异系数均小于10...

【目的】建立高通量牛布鲁氏菌间接ＥＬＩＳＡ诊断方法，为科学高效诊断牛布鲁氏菌病提供技术手段。【方法】以提纯的猪布鲁氏菌Ｓ２株脂多糖（ＬＰＳ）作为包被抗原，采用棋盘滴定法确定了抗原包被浓度、包被液、抗原包被时间、封闭液、样品稀释液、血清稀释倍数、兔抗牛酶标抗体稀释液、兔抗牛酶标抗体稀释浓度、最佳ＴＭＢ底物反应时间等参数，初步建立了牛布鲁氏菌间接ＥＬＳＩＡ方法。并用上述条件初步建立的方法对１７６份牛布鲁氏菌病阳性血清和１３２份牛布鲁氏菌病阴性血清进行检测。检测结果经ＳＰＳＳ１７．０软件分析，构建受试者工作特征曲线（ＲＯＣ）及曲线下面积，确定敏感性和特异性；通过ＹＯｕｄＥｎ指数确定阴阳性判定的临界点．．．

【目的】建立羊伪结核棒状杆菌抗体的间接ＥＬＩＳＡ检测方法。【方法】分别用不同浓度的伪结核棒状杆菌菌体抗原和培养上清可溶性抗原包被酶标板，用脱脂奶粉封闭酶标板，设置封闭时间分别为１．０，１．５和２ｈ，再用不同稀释度的血清（１∶１００，１∶２００，１∶４００和１∶８００）与之反应，以此优化间接ＥＬＩＳＡ反应条件，确定阳性结果判定的临界值。对间接ＥＬＩＳＡ方法的特异性和重复性进行考察，并在此基础上对采集的临床样本进行检测。【结果】选用伪结核棒状杆菌菌体为包被抗原，最佳包被抗原菌体密度为ＯＤ６００＝０．０８，血清的最佳稀释度为１∶４００，封闭时间为２ｈ，阳性血清的临界值为０．３２９。该抗体检测方法可特．．．

【目的】获得产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)的无毒重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。【方法】对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因按照大肠杆菌偏爱密码子进行优化设计。同时,将第106位的组氨酸和第199位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸和谷氨酸,经人工合成,获得基因片段GETX_(m2)。将GETX_(m2)克隆至原核表达载体p ET30a-(+)后,将p ET30a-GETX_(m2)转化至BL21(DE3)感受态细胞中,在15℃和37℃两种条件下分别用IPTG诱导16 h和4 h,超声破碎后收集上清和沉淀,采用SDS-PAGE和Western blot方法检测重组蛋白的表达情况及其可溶性。利用Ni-IDA亲和层析方法对可溶性表达的重组蛋白进行纯化,从而获得重组蛋白r ETX_(m2)。利用Western blot方法,检测r ETX_(m2)与D型产气荚膜梭菌ETX抗血清的反应性。将r ETX_(m2)用细胞维持液稀释至100及10μg·m L~(-1),检测其对犬肾细胞系(MDCK细胞)的毒力。分别用胰酶活化前和活化后的r ETX_(m2),以0.0625、0.625和6.25 mg·kg~(-1) 3个剂量尾静脉注射,检测r ETX_(m2)对小鼠的毒力。随后,将r ETX_(m2)与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,取4只健康家兔,皮下免疫2次(间隔两周),100μg/只。同时,Montanide ISA 201佐剂与PBS混合液免疫组作为对照组。分别在一免后14 d以及二免后21 d,采血,分离血清,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测血清对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价。同时,在二免后21 d,对家兔经耳缘静脉注射1个家兔MLD的D型产气荚膜梭菌毒素,检测r ETX_(m2)对家兔的免疫保护效果。【结果】在15℃和37℃条件,r ETX_(m2)在BL21(DE3)菌体中均以可溶性和包涵体两种形式表达,综合考虑重组蛋白的表达量、可溶性及诱导时间,选择纯化在37℃条件下诱导获得的可溶性r ETX_(m2)。灰度扫描结果显示,在37℃诱导条件下,r ETX_(m2)可溶表达比例达30%;Western blot检测结果表明,D型产气荚膜梭菌毒素抗血清能够特异性的识别r ETX_(m2),出现特异性反应条带。MDCK细胞毒性实验显示,在r ETX_(m2)浓度为100μg·m L~(-1)的细胞培养基中孵育24 h后,细胞未出现细胞病变,而2 000倍稀释的D型产气荚膜梭菌天然毒素细胞培养基孵育组的细胞出现了明显的细胞病变;小鼠安全试验显示,尾静脉注射6.25 mg·kg~(-1)剂量的r ETX_(m2),对小鼠无致死性;血清中和试验结果显示,r ETX_(m2)免疫组每毫升的一免兔抗血清可中和450—750个小鼠MLD,每毫升的二免兔抗血清可中和2 500—4 000个小鼠MLD的D型产气荚膜梭菌毒素,而对照组的兔抗血清对D型产气荚膜梭菌毒素无中和作用;用1个家兔MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔4/4保护。【结论】产气荚膜梭菌r ETX_(m2)毒力基本丧失,但保留了良好的免疫原性,是D型产气荚膜梭菌病基因工程亚单位疫苗的理想候选抗原蛋白。

为建立检测PCV2抗体的间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),将猪圆环病毒2(porcine circovirus type 2,PCV2)结构蛋白Cap(不含核内化信号肽)的基因克隆到原核表达载体pET 28a(+)中,并在大肠杆菌中表达,获得可溶性的重组蛋白(Cap⊿41),用Cap⊿41作为诊断抗原,确立了间接ELISA的最佳反应条件,并对来自4个猪场的394份血清进行检测。结果表明,与免疫荧光检测相比,建立的间接ELISA的检测敏感性和特异性分别为93.14%和95.72%,且建立的间接ELISA的批内与批间差异较小。此...

【目的】通过筛选引起马流产的4种沙门氏菌（Salmonella）共同的优势抗原，建立一种敏感高、特异强的通用型间接ELISA(iELISA)抗体检测方法，实现对马群中沙门氏菌抗体的快速高通量检测。【方法】首先利用马流产沙门氏菌阳性血清、阴性血清分别与马流产沙门氏菌全菌抗原进行免疫共沉淀（pull down）试验，筛选出马流产沙门氏菌优势抗原；根据质谱分析结果找到优势抗原基因，将优势抗原基因与其他3种致马流产沙门氏菌病的鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌进行序列比对验证其保守性；其次根据抗原性分析对优势抗原编码基因进行分段表达，设计3对引物，利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增沙门氏菌优势抗原基因并将其分别克隆至原核表达载体pET28a；测序分析后将构建正确的重组质粒分别转化入大肠杆菌(Escherichia coli E.coli)Rosetta(DE3)中并加入0.6 mmol·L~(-1)异丙基-β-D-硫代半乳糖甘(Isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG）进行诱导表达，观察蛋白的表达形式；蛋白纯化后通过Western blot验证蛋白的反应原性和广谱性；然后利用纯化后蛋白作为包被抗原，通过对包被抗原量、血清和第二抗体浓度等条件进行优化建立马流产沙门氏菌病间接ELISA抗体诊断方法，并对该方法的特异性、敏感性进行评估。最后将该方法应用于试验感染马血清及临床样本的检测，并将检测结果同凝集试验结果比较。【结果】筛选出的马流产沙门氏菌优势抗原是ompA(Outer Membrane Protein, OMP)，通过序列比对，该蛋白氨基酸序列与同属鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌同源性99.4%—100%，具有很好的保守性；PCR扩增后成功获得3条与预期符合的目的基因；成功构建了pET28a-ompA1、pET28a-ompA2、pET28a-ompA33个重组质粒。SDS-PAGE结果表明，在24℃、0.6 mmol·L~(-1) IPTG诱导5 h下，含有pET28a-ompA1、pET28a-ompA2、pET28a-ompA3的重组菌均表达了相应蛋白，其中重组ompA1和ompA2蛋白以包涵体形式表达，重组ompA3蛋白以可溶性形式表达；Western blot显示，重组蛋白ompA3可与马流产沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌阳性血清发生特异性反应，证明重组ompA3蛋白具有良好的反应原性，可以作为沙门氏菌属抗血清检测用抗原；以ompA3蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法，在最大P/N比确定的最佳反应条件如下：最佳包被抗原浓度为1μg·mL~(-1)，待检血清（1﹕200）37℃作用1 h，酶标抗马二抗（1﹕10 000稀释），TMB在37℃孵育10 min，待检血清OD450>0.143判定为阳性，特异性试验结果显示，该包被抗原与常见马传染病阳性血清无交叉反应。通过对沙门氏菌静脉注射感染马的血清样品进行抗体检测，iELISA可以持续监测抗体阳性到116 d，相比微量凝集（69 d）多监测了47 d，因此iELISA具有更好的敏感性。利用建立的iELISA方法对8个不同牧场180份血清进行抗体检测，其抗体平均阳性检出率为63.3%，比微量凝集阳性检出率高53.9%。【结论】成功筛选到了马流产沙门氏菌病4种病原的共同优势抗原ompA，实现了对该蛋白的可溶性表达，建立了马流产沙门氏菌病通用型iELISA抗体诊断方法，该方法可以实现对临床样本马流产沙门氏菌抗体的检测，该方法具有特异性强、敏感性高，可以作为马流产沙门菌病抗体检测的一种有效工具。

为了检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)抗体,本试验建立了快速、敏感的ELISA诊断方法.通过比较差速离心、蔗糖不连续梯度离心、氯化铯等密度梯度离心和氯仿抽提结合超速离心等4种方法纯化PCV2抗原的包被效果,来确定最佳的PCV2包被抗原纯化方法,在此基础上,通过全病毒抗原最适包被浓度和二抗HRP-SPA稀释倍数的确定、待测血清稀释倍数的确定、封闭液浓度的确定、封闭时间的确定、HRP-SPA反应时间的确定、临界值的确定、特异性测定、重复性测定、符合率比较等,进一步优化检测PCV2抗体的间接ELISA方法.结果表明:对猪的多种病毒阳性血清进行ELISA检测,只有PCV2阳性血清呈阳性;对6份血清进行4次...

为建立一种用于快速检测赤羽病病毒抗体的竞争ELISA法。用AKV病毒免疫Balb/C小鼠，将其脾细胞与SP2/0细胞进行免疫融合，以获得抗AKV的单克隆抗体；利用Bac-to-Bac杆状病毒表达的SBV N蛋白作为诊断特异性抗原，山羊抗鼠HRP-IgG为二抗，建立并优化AKV抗体检测的竞争ELISA方法。得到一株持续稳定繁殖的能够分泌单抗AKV核蛋白抗体的杂交瘤细胞株，单抗亚型鉴定为：重链IgG1,轻链kappa,仅能与AKV病毒呈阳性反应，与BTV、FAMD、EHDV病毒等病毒抗原不发生特异性反应；建立的检测AKV抗体ELISA检测方法，诊断抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,1∶1 000抗体稀释比，1∶50血清稀释比，1∶2 000二抗稀释比，封闭条件为5%BSA,37℃封闭2 h,确定了血清抑制率大于等于44%时为阳性，小于44%为阴性；所建立的ELISA方法敏感性和特异性鉴定结果与ID Screen AKV Competition检测试剂盒一致。本试验成功制备出一株分泌针对AKV N蛋白的杂交瘤细胞系，建立的ELISA检测方法能够用于检测动物AKV抗体，为进一步开展AKV抗体诊断试剂工艺研究、产业化奠定了基础。

【目的】研究并建立大豆抗原蛋白血清抗体间接ELISA检测方法。【方法】首先用大豆抗原蛋白对仔猪进行致敏,然后采用棋盘滴定法确定最佳抗原包被质量浓度及血清稀释倍数,并对其他条件进行优化,最终建立检测血清大豆抗原蛋白11S、7S抗体的间接ELISA方法,确立待测血清判定标准,并对建立的ELISA方法进行重复性、准确性和敏感性检测。【结果】建立的ELISA方法的最佳反应条件为:11S抗原蛋白最适包被质量浓度为2.0μg/mL,包被作用时间37℃下2h;将10g/L BSA作为封闭液,37℃封闭1h;待测血清37℃作用1h;酶标二抗最适稀释度为1∶1 500,37℃作用1h;显色剂最佳显色时间15mi...

以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核衣壳蛋白(rN蛋白)为抗原,初步建立了检测PRRSV抗体的rN-ELISA方法。根据GenBank公布的PRRSV VR2332株编码核衣壳蛋白的ORF7基因序列设计合成了一对引物,成功扩增出ORF7基因。将其克隆到PET-30a构成原核表达载体,转化宿主菌BL21(DE3)并获得表达。通过SDS-PAGE和Western blot检测证实rN蛋白获得了高效表达,且具有良好的免疫学活性。以纯化的重组蛋白为抗原建立检测PRRSV抗体的间接ELISA法。试验证明,该方法与IDEXX公司生产的PRRSV抗体检测ELISA试剂盒对同批临床血清样本的检测结果完...