【目的】探讨五指山小型猪近交系主动脉内皮细胞体外分离培养和鉴定的方法,研究LPS对内皮细胞TLR2表达的影响及TLR2介导内皮细胞炎症因子的表达情况。【方法】以3—4月龄的五指山小型猪近交系为试验材料,取其胸腹主动脉,采用0.1%I型胶原酶消化分离主动脉内皮细胞。利用细胞吸收DiI-Ac-LDL试验和流式细胞仪检测CD31的特异表达两种方法进行内皮细胞的鉴定。1μg.mL-1LPS刺激内皮细胞0、6、8和12 h,实时荧光定量PCR检测TLR2和TLR4的表达量;1μg.mL-1LPS刺激内皮细胞12 h后,10μg.mL-1LTA孵育0、6和12 h,实时荧光定量PCR检测炎症因子IL-6、...

【目的】为探讨五指山小型猪(WZSP)近交系群体中SLAⅠ3(SLA-3)位点等位基因分布结构及其特性。【方法】利用4对引物,采用RT-PCR扩增了32头WZSPSLA-3基因部分外显子1、外显子2和大部分外显子3序列。根据家系和扩增结果,选择8头个体的PCR产物克隆测序。【结果】获得9个不同的核苷酸序列。与GenBank中所用SLA-3基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行比较分析,确定这9个序列均为SLA-3位点上的新等位基因,但这些等位基因间核苷酸变异很少;氨基酸序列比较发现猪和人之间有很高的保守性。同时,构建了23个SLA-3的等位基因和1个HLA-A等位基因核苷酸序列的系统树。【结...

采用组织贴块法培养肉鸡肺动脉内皮细胞(PAEC),并依据细胞形态学特点和凝血因子Ⅷ相关抗原免疫组化染色结果对所培养的细胞进行鉴定。以黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶(X/XO)系统作为氧自由基发生系统建立PAEC氧化损伤模型。结果表明:肉鸡PAEC在体外能够存活并传5-6代。形态学观察和Ⅷ因子抗原免疫组化染色检查证明培养的细胞符合肺动脉内皮细胞的特点。氧自由基能够明显损伤PAEC,X/XO系统作用下细胞生长被抑制,甚至导致细胞死亡,并且这种抑制作用对XO有剂量依赖性。与正常对照组相比,损伤组PAEC培养液中脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量升高,提示氧自由基促进了PAEC的脂质过氧化。这说明氧自由基对肉鸡...

【目的】通过碱性调宁蛋白(h1-calponin)基因与五指山小型猪骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM MSCs)成骨分化关系的研究,探讨成骨分化机制。【方法】添加成骨分化液对BM MSCs进行成骨分化诱导,采用茜素红染色的方法鉴定细胞成骨分化的程度;通过定量PCR分析h1-calponin基因及成骨相关基因骨桥蛋白(osteopotin,OPN)、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、核心结合因子α1(core binding factor a1,Cbfα1)及核心结合因子β(core binding factor beta,C...

探讨大鼠脑微血管内皮细胞的体外培养方法,为研究猪链球菌引起脑膜炎的致病机理打下基础。采用脑组织匀浆、二次过筛及酶消化技术分离大鼠脑微血管段,对分离的脑微血管内皮细胞进行了体外培养、形态学观察、免疫荧光鉴定及生长曲线的MTT法测定。结果表明:倒置显微镜下,细胞具有单层"铺路石样"排列的典型特征,免疫荧光检测第Ⅷ因子相关抗原呈阳性,成功建立了大鼠脑微血管内皮细胞的体外培养方法。

为建立广西巴马小型猪腹部成纤维细胞、耳成纤维细胞、睾丸成纤维细胞、肺部成纤维细胞及脾成纤维细胞体外培养体系,以新生巴马小型猪为试验材料,使用微量液体组织块贴壁法原代培养分离几种成纤维细胞,进行常规传代培养、冷冻和复苏;根据细胞的形态、生长特性等观察其体外生长能力和增殖寿命。结果显示,广西巴马小型猪腹部成纤维细胞、耳成纤维细胞、睾丸成纤维细胞、肺部成纤维细胞及脾成纤维细胞获得成功分离,体外可以传代和冷冻;冷冻复苏后仍可以正常培养和传代;腹部成纤维细胞免疫荧光检测结果显示波形蛋白表达阳性,角形蛋白表达阴性。研究成果可为显微操作核移植、手工核移植和转基因相关操作等提供不同类型的供体材料。

通过ＰＣＶ２病毒感染３Ｄ４／２１猪肺泡巨噬细胞后炎症相关细胞因子ｍＲＮＡ转录水平变化，探讨ＰＣＶ２感染后可能的致病途径。通过ＰＣＶ２病毒体外接种３Ｄ４／２１细胞，感染不同时间后，收集样品，采用荧光定量ＰＣＲ方法检测细胞因子ＩＬ－１β、ＩＬ－８及ＩＬ－１８ｍＲＮＡ转录水平的变化。结果显示ＰＣＶ２对３Ｄ４／２１细胞的ＩＬ－１β、ＩＬ－８转录主要起抑制作用，对ＩＬ－８转录起促进作用。推测其在体内的综合效应导致感染早期机体抗病毒能力降低，引起机体免疫抑制，影响机体特异性免疫应答的正常运转，为ＰＣＶＤ的发病创造了条件。

为揭示Ghrelin在绵羊卵母细胞的表达情况,运用实时定量RT-PCR技术检测不同培养系统中绵羊卵母细胞Ghrelin mRNA的相对表达量。结果表明,以M199和血清为基础培养基添加不同激素后培养的卵母细胞GhrelinmRNA相对表达量均显著上升,仅以M199为基础培养基添加不同激素后培养的卵母细胞Ghrelin mRNA相对表达量均显著下降。在不同基础培养基中添加不同激素后,E2较FSH和LH有促进Ghrelin mRNA相对表达量升高的趋势。绵羊卵母细胞Ghrelin mRNA的表达以及在不同培养系统动力学变化,提示了这一新型分子在卵母细胞成熟过程中受激素潜在的调控作用。

探索简单快速实用的鸡胚肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞培养方法:在严格无菌条件下对肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞分离培养,待细胞融合度达约80%时进行传代,得到的内皮细胞利用差速消化法纯化,并观察2种细胞形态特征及培养特性,待细胞稳定生长后,采用荧光免疫组化技术鉴定细胞,并进行冻存和复苏,观察复苏后细胞活性。结果显示:24 h后组织块周围即有少量细胞爬出,内皮细胞大量生长后呈突起状排列,立体感强,平滑肌细胞在培养后的第5天呈现"峰谷"样外观,经免疫荧光法证明是内皮细胞和平滑肌细胞的纯培养,冻存于液氮中1~2个月复苏后细胞的活性都较好,可以恢复旺盛生长。结论:本研究提出的组织贴块法能成功获得内皮细胞和平滑...

　采用1g/L胶原酶灌注猪脐静脉,消化分离内皮细胞并在适宜条件下培养。对培养细胞的生长特性进行检测,并对细胞进行第 因子相关抗原(F- RAg)和扫描电镜形态学鉴定。结果表明,70%细胞在24h内贴壁,第3～5天生长迅速,第4～5天长成单层。培养的细胞呈单层贴壁生长,典型铺路石状,第 因子相关抗原(F- RAg)检测阳性,证明培养的细胞为血管内皮细胞。

应激反应对暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)养殖业危害极大，而皮质醇(Cortisol)是判断鱼类应激反应的重要标志物。肠道是鱼体与外界环境接触的媒介，肠道生理状态能反应鱼体的应激水平，但目前肠道在鱼类响应应激反应中的作用不详。本研究以暗纹东方鲀肠上皮细胞为对象，分别采用胰蛋白酶和DMEM培养基、胰蛋白酶和1640培养基、Ⅰ型胶原酶和DMEM培养基、Ⅰ型胶原酶和1640培养基4种方法对其进行原代培养，旨在建立暗纹东方鲀原代肠上皮细胞体外培养方法，并在此基础上探讨皮质醇对暗纹东方鲀肠上皮细胞氧化应激、细胞凋亡和脂代谢的影响。利用CCK-8法检测肠上皮细胞活力，透射电镜观察皮质醇处理后细胞内线粒体的形态结构，荧光定量PCR (qRT-PCR)检测氧化应激相关基因、细胞凋亡相关基因及脂代谢相关基因在肠上皮细胞内的表达模式，Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡等。结果显示，在4种培养方法中，采用胰蛋白酶消化和DMEM培养基进行培养的肠上皮细胞增殖率最高，贴壁情况最佳；与对照组相比，当皮质醇浓度高于2 000 nmol/L时，肠上皮细胞活力显著下降(P<0.05)；透射电镜显示，所有皮质醇处理组肠上皮细胞内线粒体结构发生改变，线粒体数量增加；随皮质醇处理浓度的升高，肠上皮细胞内氧化应激相关基因(sod、cat和gsh-px)及促凋亡基因(caspase-3、caspase-7、caspase-9、bax和p53)表达量和凋亡指数均显著上升，抗凋亡基因bcl-2表达量显著下降(P<0.05)；脂肪合成相关基因(g6pd、6gpd、pparγ、fas和acc)表达量显著下降，脂肪分解相关基因(hsl、pparα、lpl和cpt-1)表达量显著上升(P<0.05)；TG和TC含量显著下降，NEFA含量显著上升(P<0.05)。结果表明，皮质醇能够促进暗纹东方鲀肠上皮细胞的氧化应激和细胞凋亡，同时促进脂肪的分解并抑制脂肪的合成。本研究以期为暗纹东方鲀抗应激养殖提供一定的参考资料。

为分析苜蓿素对脂多糖诱导下体外培养奶牛乳腺上皮细胞抗炎和乳蛋白合成相关基因表达的影响,本研究将体外培养的奶牛乳腺上皮细胞分成4组,即基础培养基(对照)和基础培养基中分别加入1μg·m L-1LPS(L)、1μg·m L-1LPS+10μg·m L-1苜蓿素(L+T)和10μg·m L-1苜蓿素(T)。结果显示,1)与对照组相比,L组奶牛乳腺上皮细胞的活性显著下降(P<0.05),而T组则显著升高(P<0.01)。2)L+T组细胞的超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于L组(P<0.01),而一氧化氮(NO)

【目的】阐明产肠毒素大肠杆菌F18(ETEC F18)引发仔猪腹泻的机理,针对其候选基因FUT1的CDS区第307位点处的突变(G→A),建立3个仔猪小肠黏膜上皮细胞系(GG、GA和AA)。【方法】首先以胎鼠和仔猪为试验材料,确定小肠上皮细胞的最佳分离方法。采用XI型胶原酶和I型中性蛋白酶的联酶混合液,将胎鼠小肠组织机械剪碎后用联酶进行消化和直接将联酶灌注到仔猪小肠腔内消化的两种方法进行比较。针对仔猪小肠黏膜上皮细胞体外培养过程中成纤维细胞污染难以消除的问题,本研究采用局部画圈法逐步去除成纤维细胞。最后,用电镜和CK18免疫荧光染色对纯化后的原代仔猪小肠黏膜上皮细胞进行鉴定。【结果】两种小肠上...

为探讨白头翁汤及其主要成分对细菌内毒素(LPS)诱发的病理效应的药理作用,培养内皮细胞至单层融合后加入内毒素,3 h后加入高(10 mg·mL-1)、中(5 mg·mL-1)、低(1 mg·mL-1)3种剂量的8种药物,继续培养21 h后收集细胞上清液,用ELISA方法测定IL-1α、IL-6和ET-1的含量。结果表明:白头翁汤及其成分白头翁皂苷B4、小檗碱、巴马汀可以极显著或显著抑制LPS诱导的IL-1α高水平分泌,白头翁汤及其成分秦皮甲素、秦皮乙素、白头翁素可以极显著或显著抑制LPS诱导的IL-6高水平分泌,白头翁汤及其成分秦皮乙素、白头翁素可以极显著或显著抑制LPS诱导的ET-1高水平分...

为了建立以CYP1A cDNA为探针的水环境毒理学细胞模型,以β-萘黄酮(BNF)作为诱导剂,通过半定量PCR技术研究CYP1A在草鱼不同细胞系及其对应组织中的诱导表达情况。在半定量PCR反应参数研究中,对关键的退火温度和循环次数进行了优化,结果显示退火温度为57℃,循环次数为30次较为合适,该条件下Gauss迹量的CYP1A/ACT比值能更准确的反映CYP1A的表达水平。对照组和诱导组草鱼细胞中ACT和CYP1A cDNA扩增结果表明,细胞中CYP1A的基础表达量较低,而BNF诱导使GCL、CIK和CO细胞中CYP1A的表达水平得到显著的提高。GCL、CIK和CO细胞三者之间诱导后CYP1A...