【目的】前期研究证实linc-NORFA作为母猪繁殖性状候选基因参与调控卵泡闭锁与卵泡颗粒细胞凋亡过程,进一步鉴定二花脸猪linc-NORFA核心启动子并分析其转录调控机制,为解析linc-NORFA介导猪卵泡闭锁的分子机制奠定理论基础并提供新的研究思路。【方法】采集二花脸猪耳组织样品并提取基因组DNA,利用PCR扩增和测序技术获得二花脸猪linc-NORFA5′调控区序列;通过构建缺失表达荧光报告载体并利用荧光素酶活性试验鉴定二花脸猪linc-NORFA核心启动子;利用生物信息学分析二花脸猪linc-NORFA核心启动子区序列特征与潜在的转录因子结合位点;构建猪FOXO1真核生物表达载体并进一步采用Western blot、qRT-PCR以及荧光素酶活性试验分析转录因子FOXO1过表达对二花脸猪linc-NORFA转录的影响;利用染色质免疫沉淀(ChIP)技术鉴定转录因子FOXO1与二花脸猪linc-NORFA核心启动子区的结合能力。【结果】通过克隆测序与序列拼接共获得二花脸猪linc-NORFA 5′调控区序列1 734 bp,其中包含两个潜在的CpG岛;利用荧光素酶活性试验证实linc-NORFA核心启动子位于-988—-684 bp(转录起始位点作为+1),生物信息学分析表明二花脸猪linc-NORFA核心启动子上包含多个转录因子的结合元件,例如ESR2、FOXO1、E2F1、BRCA1以及NFIC等;另外,ChIP试验还证实在猪卵巢颗粒细胞中FOXO1作为转录因子直接靶向结合在linc-NORFA的核心启动子区;进一步通过试验证实FOXO1过表达可显著下调linc-NORFA核心启动子区活性(P<0.01),同时显著抑制体外培养的猪卵巢颗粒细胞中linc-NORFA的表达(P<0.01)。【结论】鉴定了二花脸猪linc-NORFA核心启动子区,同时证实FOXO1作为转录因子能够与linc-NORFA核心启动子区特异性结合,进而抑制后者的转录活性与表达。研究结果对探究linc-NORFA在猪卵泡闭锁过程中显著下调的分子机制具有重要意义。

为研究胞内氯离子通道5基因(Chloride intracellular channel 5,CLIC5)广泛参与调节细胞内的各项生理活动与生化反应,并探讨该基因自身的表达调控机制,以小鼠基因组序列为模板,利用PCR技术扩增小鼠CLIC5基因5′上游调控序列,将其插入荧光素酶报告基因表达载体(pGL3-Basic)中,同时采用5′侧翼区缺失的方法构建了7个缺失不同DNA片段的荧光素酶表达载体。重组质粒与海肾荧光素酶载体(phRL-TK)共同瞬时转染HEK-293细胞,经双荧光素酶报告基因活性分析后,确定CLIC5基因的核心启动子区。利用生物信息学方法预测其中转录因子结合位点及启动子区甲基化状况...

旨在初步分析猪CRYBB2的启动子活性以及转录调控元件。利用生物信息学分析、PCR扩增、基因克隆、细胞转染、双荧光素酶活性分析等方法，获得了CRYBB2启动子区域的序列特征，构建了不同片段长度的CRYBB2启动子区的双荧光素酶报告基因载体并分析了其荧光素酶活性，进而确定了CRYBB2的核心启动子区域以及关键的调控区域，最后还预测了关键调控区域的转录因子及其结合位点。结果表明，CRYBB2候选启动子区可能包含4个核心启动子以及1个CpG岛，-52～-3 bp可能为CRYBB2基因的核心启动子区域，-505～-19 bp为CRYBB2基因启动子的关键调控区域，且发挥正向调节作用，而-2 060～-505 bp不存在任何对CRYBB2基因启动子活性有影响的调控元件；CRYBB2启动子的关键调控区域包含多个潜在的转录因子结合位点，如TBP、NFIA、FOXP1、NKX2-8、KLF4、Tcf3、Crx、SNAI3、Rfx1和CREB1等。为进一步研究猪CRYBB2的表达机制奠定了基础。

为鉴定牛叉头框转录因子1(Forkhead box,FoxO1)的核心启动子区及其关键转录因子，利用PCR扩增牛FoxO1基因的启动子序列，同时设计7个逐段缺失片段引物扩增其启动子逐段缺失片段，进一步将其构建双荧光素酶报告载体并分别转染小鼠C2C12和3T3-L1细胞系，通过检测不同缺失片段荧光素酶报告载体的活性，以确定牛FoxO1启动子的核心区域；使用Genomatix和JASPAR在线软件预测牛FoxO1基因启动子核心区域的关键转录因子，采用定点突变试验在小鼠C2C12细胞系中初步鉴定预测的关键转录因子对FoxO1的转录调控作用。结果表明：1）成功扩增了牛FoxO1的启动子区1 920bp序列，获得了FoxO1基因启动子序列的7个逐段缺失片段序列；2）经双荧光素酶报告试验进一步证实，牛FoxO1基因核心启动子位于-285/-27区域；3）预测并通过定点突变试验鉴定出MEF2A、KLF4、HOXA5和KLF5转录因子对FoxO1基因的转录活性具有关键调控作用。综上，本研究初步鉴定出牛FoxO1基因启动子核心区（-285/-27）内转录因子MEF2A、KLF4、HOXA5和KLF5对FoxO1基因有重要的转录调控作用，为FoxO1基因对牛肌肉脂肪发育过程中的转录调控机制奠定了一定理论基础。

旨在初步分析猪EIF2S3基因的启动子活性以及转录调控元件。利用生物信息学分析、PCR扩增、基因克隆、细胞转染、双荧光素酶活性分析等方法,获得了EIF2S3基因启动子区域的序列特征,构建了不同片段长度的EIF2S3基因启动子区的双荧光素酶报告基因载体并分析了其荧光素酶活性,进而确定了EIF2S3基因的核心启动子区域以及关键的调控区域,最后还预测了关键调控区域的转录因子及其结合位点。结果表明,EIF2S3基因候选启动子区包含3个核心启动子以及2个Cp G岛;-706～+200 bp为EIF2S3基因的核心启动子区域,-706～-253 bp为EIF2S3基因启动子的关键调控区域,且发挥正向调节作用,而-1 563～-706 bp不存在任何对EIF2S3基因启动子活性有影响的调控元件; EIF2S3基因启动子的关键调控区域包含440个转录因子结合位点,且多个转录因子在此区域均有多个结合位点,如SP1、KLF4、Myo D1、Myo G、NFKB1。为进一步研究猪EIF2S3基因的表达机制奠定了基础。

脂肪甘油三酯水解酶(ATGL)是脂肪水解过程中的主要限速酶，是调控细胞中甘油三酯和脂肪酸之间平衡的关键因子。为了分析奶山羊ATGL基因启动子的结构及转录调控机制，以奶山羊全血DNA为模板，通过PCR技术扩增出ATGL基因5′侧翼序列并进行生物信息学分析；构建了5个不同长度的启动子缺失片段报告基因载体，通过转染奶山羊乳腺上皮细胞并检测其活性，确定其核心区域；分别用PPARG激动剂罗格列酮和SREBP1激动剂T0901317处理细胞，检测其对ATGL启动子活性的影响。结果表明，克隆得到奶山羊ATGL基因5′侧翼序列2 721 bp,包含转录起始位点上游2 024 bp。经在线软件分析发现，ATGL启动子含有真核生物启动子元件TATA-box和CpG岛；对转录因子结合位点预测发现，其上含有FOXO、SREBF1、PPARG、C/EBPα和E2F1等结合位点。启动子活性分析结果表明，ATGL启动子核心区域位于转录起始位点上游-256—+1位，且在-527—-256位存在负调控元件。用罗格列酮和T0901317处理细胞后发现，二者均能显著上调ATGL启动子活性，且罗格列酮作用的区域为-527—-256位，T0901317在-882—-527位发挥作用，表明PPARG和SREBP1调控ATGL启动子活性。

采用PCR-RFLP方法分析大约克猪和二花脸猪SLA-DRB外显子2的多态性。结果显示:RsaⅠ酶切后得到3种等位基因条带,分别为A(141/93/11 bp)、B(111/69/54/11 bp)、D(93/48/39/54/11 bp)。χ2检测表明:二花脸猪SLA-DRB基因外显子2处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),而大约克猪处于非平衡状态(P<0.01)。两品种A等位基因均为优势等位基因,AA型为主要基因型,其频率在品种间无显著差异。首次发现等位基因B、D分别出现在二花脸猪和大约克猪中,有望用于区分两品种。

NR5A2是孤儿核受体家族中的重要成员,在胚胎发育、类固醇激素生成、卵泡发育和排卵中发挥重要作用。经克隆和测序获得二花脸猪NR5A2基因编码区序列,采用RT-PCR技术分析其组织表达特征,并采用荧光定量PCR技术检测二花脸猪与杜长大三元杂交猪卵巢组织中NR5A2基因转录水平。结果表明:二花脸猪NR5A2基因编码区序列长1 506 bp,编码蛋白含有DNA结合域、Ftz-F1盒和配体结合域等保守结构域。二花脸猪NR5A2基因在各种组织中广泛表达,特别是在卵巢组织中高表达,且卵巢组织中转录水平显著高于杜长大三元杂交猪(P<0.05)。推测二花脸猪NR5A2基因在卵泡发育和排卵中发挥重要作用,并可能...

【目的】构建以缺失不同功能区的猪内源性反转录病毒(PERV)5′非编码区(5′UTR)为启动子的萤光素酶表达载体,分析5′UTR的转录调控规律。【方法】将含有不同功能域的PERV的UTR克隆至萤光素酶表达载体上,转染瞬时表达细胞Cos-7,检测萤光素酶的表达。【结果】缺失R区的5′UTR显示出很强的启动子活性,U3重复区序列缺失的5′UTR启动子活性显著下降。UTR显示出较之LTR强的启动子活性。缺失整个U3区的UTR比仅缺失U3重复区的UTR启动子活性强。【结论】在R区有转录因子的结合位点可引起转录活性下降;U3重复区序列表现出增强子的活性。在5′UTR的下游序列中,包括引物结合区(PBS)...

旨在克隆和分析猪STAB2基因启动子及其转录活性。利用基因克隆、双荧光素酶报告基因系统以及生物信息学分析等方法,克隆得到了STAB2基因转录起始位点上游1 997 bp的候选启动子序列并对其序列特征进行了分析,同时,构建了不同长度的5’端缺失的重组载体并利用双荧光素酶报告基因系统分析了其荧光素酶活性,进而确定了STAB2基因的核心启动子区域及关键调控区域,并对关键调控区域内的转录因子及其结合位点进行了分析。结果表明:STAB2基因的候选启动子区域内包含4个核心启动子和1个Cp G岛;-309--39 bp为STAB2基因的关键调控区域,-1 045--309 bp可能存在一个正向调控元件,而-1 506--1 045 bp可能存在一个负向调控元件; STAB2基因的关键调控区域内包含72个转录因子结合位点,部分转录因子在这一区域具有多个结合位点,如Arnt∶∶Ahr、ZNF354C、Klf4和KLF5,并且,转录因子结合位点之间也存在重合区。为进一步研究猪STAB2基因的表达调控机制以及其在调控猪抗病和肌肉品质中的功能提供了理论依据。

为探索鱼类转铁蛋白基因tf和转铁蛋白受体基因tfr1a的转录调控机制,本实验以团头鲂为研究对象,在其全基因组数据库中获取tf和tfr1a基因序列,对2个基因候选启动子区转录因子结合位点及CpG岛进行预测,通过PCR方法克隆得到tf和tfr1a基因近端启动子区不同长度片段,连接至pGL3-Basic/pEGFP-1载体,瞬时转染入Hela细胞,并采用双荧光素酶报告基因检测系统进行检测。结果发现,团头鲂tf基因启动子区无CpG岛位点,而tfr1a基因启动子区有2个CpG岛位点。成功构建9个tf和10个tfr1a不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶报告基因系统检测发现,tf启动子核心区域为-268～+56 bp,且-1 308～-1 102 bp片段可能存在正调控该基因表达的转录因子结合位点;tfr1a启动子核心区域为-224～+48 bp,且+48～+92 bp可能存在抑制该基因转录的负调控元件,而-1 229～-1 219 bp区域可能存在促进tfr1a基因表达的正调控转录因子结合位点。

【目的】Sry是大多数哺乳动物雄性性别发育的决定基因,但人们仍未找到其表达的调控规律,本试验对牛Sry5′端调控序列作了初步的研究,为深入研究牛Sry的表达调控奠定了基础。【方法】克隆牛Sry5′端侧翼1056bp长的DNA序列,利用生物信息学方法对这一区域内潜在的转录起始位点进行了预测,并构建了10个不同长度的缺失牛Sry5′部分侧翼序列的报告基因载体;进一步分离了胎牛生殖嵴,进行生殖嵴细胞的原代培养,并对胎牛生殖嵴细胞进行了性别和特征鉴定;最后利用荧光素酶双报告基因分析系统,在生殖嵴细胞内检测了牛Sry核心启动子区域的位置。【结果】体外培养的生殖嵴细胞可以表达雄性生殖嵴细胞的特征基因Sry...

通过双荧光素酶报告基因载体系统检测猪抗酶１（ＡＺ１）基因启动子转录活性，分析蓝塘和长白猪群体ＡＺ１基因启动子ＳＮＰ及单倍型，在此基础上比较不同单倍型转录活性。结果表明：－４５３／＋７９为核心启动子区；在２个群体中检测到ＡＺ１基因启动子８个ＳＮＰＳ，分别为－７１３ Ｔ＞Ｃ、－５８４ Ａ＞Ｃ、－４７６ Ｇ＞Ａ、－３６５ Ｔ＞Ｃ、－３４８ Ｃ＞Ｔ、－２９４ Ｇ＞Ｃ、－２８８ Ｔ＞Ｇ和－２３４ Ｔ＞Ｃ，蓝塘猪群体具有更丰富的单核苷酸多态性，而长白猪群体仅在－２８８座位存在ＧＧ和ＧＴ ２种基因型，其他７个ＳＮＰＳ均为纯合状态；蓝塘猪群体ＬＴＨ１单倍型（ＴＡＧＣＣＧＴＣ，－７１３／－２３４）频率为０．５２．．．

ATP6V0A4基因编码V-ATP酶的一个亚基,与H~+转运相关,是遗传性远端肾小管性酸中毒的致病基因。在前期研究中发现,民猪在遭受冷应激后其背脂中ATP6V0A4基因的转录水平发生了显著上升(P

【目的】对鸭CD8α基因启动子活性区域进行分析,为鸭CD8α基因功能和表达调控机理研究提供依据。【方法】利用前期基因组步移技术获得的鸭CD8α基因的启动子区序列,制备一系列启动子缺失突变体(-625/-1 bp,-1 110/-1 bp,-1 413/-1 bp,-2 151/-1 bp),定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic中,构建荧光素酶报告基因重组载体,采用Lipofectamine 2000将重组质粒瞬时转染DT40细胞,分析CD8α基因启动子系列缺失突变体在细胞内的转录活性。【结果】鸭CD8α基因5′侧翼区长片段具有较强的启动子活性,-1110—-625启动子活性最强,且...