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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
凌雯 龚晓明 杨震 杜念兴
应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）对畜型和禽型两个融合基因ＨＢｓＡｇ／ＬＨＲＨ的５′端分别作了改造，切去了融合基因起始密码ＡＴＧ前一段非编码序列６１个碱基，将改造后的融合基因插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｅ１１ＫＳ＋质粒中。琼脂糖凝胶电泳以及序列分析均表明改造和克隆成功。将改造后的融合基因克隆到含Ｔ７Ｐｒｏｍｏｔｅｒ强启动子的表达载体ｐＥＴ１５ｂ中，经异丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导，在Ｅ．ｃｏｌｉＤＥ３中表达，表达量占菌体总蛋白的１０％，以兔抗ＬＨＲＨ抗体进行Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测，出现阳性反应带。用抗ＨＢｓＡｇ抗体作ＥＬＩＳＡ检测，结果稀释１×１０－６时仍为阳性反应。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
徐文忠 杜念兴 李光地 汪垣
将生长抑素(ss)与乙肝表面抗原(HBsAg)融合基因(ss/HBs)克隆到痘苗病毒表达质粒pGJP-5中,通过与痘苗病毒天坛株体内重组和蚀斑挑选技术获得融合基因的重组病毒,它保持痘苗病毒原有的感染性,并能表达出 ss 和 HBsAg 产物.表达产物呈表面带 ss 决定簇的 HBsAg 杂合颗粒,并分泌到感染细胞之培养液中.杂合颗粒的大小和密度与报道的 HBsAg 颗粒相似。本文还对该重组痘苗病毒可能作为 ss 活载体苗的前景进行了讨论。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
白俊杰 马进 简清 李新辉 罗建仁 林文辉 张红军
采用聚合酶链反应 (PCR)技术对鲤和鲑生长激素cDNA的 5’端和 3’端进行定向改造。将改造后的5种基因分别克隆到大肠杆菌表达质粒 pBV2 2 0进行原核表达 ,以研究鱼生长激素基因在大肠杆菌中的表达水平。实验结果表明 :(1)核糖核蛋白体结合位点 (SD)与起始密码子AUG之间的距离对鱼生长激素的表达水平有影响 ;(2 )鲑生长激素基因的终止密码子UAG可能不会有效终止该基因在大肠杆菌中翻译的进行而造成部分通读 ,加入大肠杆菌强终止码UAA可避免通读和产生超长蛋白 ;(3)对鲤和鲑生长激素cDNA的 5’端和 3’端进行相同的修饰 ,但两者生长激素的表达量却有很大差异 ,说明基因的密码...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
白俊杰 叶星 李新辉 简清 罗建仁
用逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)方法 ,从猪脑垂体总RNA中扩增出编码猪生长激素 (GH)成熟肽基因序列 ,定向克隆至质粒pUC18。序列分析表明 ,克隆的猪GHcDNA长 5 73bp ,不含信号肽序列 ,并在该序列之前加入一起始密码子ATG。将猪GHcDNA定向克隆至原核表达载体pBV2 2 0 ,构建成重组猪GH基因表达载体pBVpGH7。SDS PAGE和薄层扫描分析表明 :经 42℃诱导 ,pBVpGH7在大肠杆菌中可表达一分子量约 2 2 0 0 0的特异蛋白 ,表达量约占细胞总蛋白的 2 0 .5 %。
[期刊] 水产学报
[作者]
陈松林 M.Schartl
应用RT—PCR技术从白鲢垂体mRNA中扩增出GH全长cDNA片段 ,长度 1.2kb。将 1.2kb白鲢GHcDNA克隆到载体质粒pBluescriptKSII +(pBSKSII +)中 ,构建了pBS -scGHcDNA克隆 ;通过含有NdeI酶切位点的特异引物扩增出不含信号肽序列的cDNA片段 ,将其重组到pRSET5b载体质粒中 ,构建了白鲢GHcDNA表达质粒pRSET -scGH。将此表达质粒转化BL2 1(DE3)大肠杆菌 ,经IPTG诱导后 ,在转化的大肠杆菌中检测到GH蛋白的存在。Western印迹表明该蛋白带与草鱼GH单克隆抗体具有强烈的免疫反应。
关键词：
鲢 生长激素cDNA 表达载体 大肠杆菌
[期刊] 水产学报
[作者]
张为民 张勇 李欣 张利红 田静
通过构建斜带石斑鱼垂体cDNA文库,克隆了其生长激素(GH)全长cDNA。斜带石斑鱼GH全长cDNA为955bp,编码的多肽为204aa。应用PCR方法把编码GH成熟肽的cDNA片段克隆到表达载体pET-15b,在大肠杆菌BL21(DE3)表达N端含6个组氨酸的融合多肽。SDS-PAGE结果表明,0.4mmol·L-1IPTG诱导表达的蛋白约为24kDa,主要为不溶性的包含体。细菌裂解液沉淀溶于6mol·L-1盐酸胍后,用Ni2+-NTA树脂进行亲和分离纯化,纯化产物在SDS-PAGE上表现为一条24kDa的蛋白带。在黑鲷GH放射免疫分析系统中,纯化产物能与黑鲷GH竞争结合GH抗体,表明大肠杆...
关键词：
斜带石斑鱼 生长激素 克隆 表达
[期刊] 中国水产科学
[作者]
郭豫杰 周开亚 马长艳
蜕皮抑制激素(molt-inhibitinghormone,MIH)属甲壳动物高血糖激素(crustaceanhyperglycemichormone,CHH)家族。MIH抑制Y 器官蜕皮激素的合成。以中华绒螯蟹(Eriocheirjaponicasinensis)眼柄总RNA为模板,根据中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Eriocheirjaponicasinensismolt inhibitinghormone 1,Ers MIH1)基因序列设计引物,用RT PCR的方法获得了Ers MIH1基因成熟肽的cDNA片段。序列分析表明,Ers MIH1基因成熟肽编码区含有228bp,编码75个氨基酸残...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
徐文忠 杜念兴 李光地 汪垣
为了将生长抑索(Somatostatin,ss)基因融合到乙肝表面抗原(HBsAg 或 HBs)基因 C 末端 Acc Ⅰ 位点(aa223位置),先将质粒 pWR13-HBs/4的多接头区 Sal Ⅰ位点消除,因为它也可被 AccⅠ酶切。在AccⅠ位点加入 Bgl Ⅱ接头,用 Sac Ⅰ和 Bg Ⅱ切下 HBs 基因片段(700bp),并将其插入到 pUC12-ss/2中 ss 基因N 末端 Sac Ⅰ和 BamH Ⅰ位置.获得基因融合体质粒 pUC12-ss/HBs。经 DNA 序列分析,两基因融合处的阅读框架正确,且 HBs 基因的起始密码 ATG 和 ss 基因全序列都得以证实.
关键词：
生长抑素 乙肝表面抗原 基因融合
[期刊] 上海水产大学学报
[作者]
曹丽萍 丁炜东
促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是下丘脑分泌产生的神经激素,对脊椎动物生殖的调控起重要作用。本研究通过RT-PCR方法从奥利亚罗非鱼丘脑中扩增出长约400 bp的目的序列GnRH,并将其克隆到T载体中,经酶切鉴定、序列测定分析后表明其与尼罗罗非鱼和乌颊海鲷具有较高的同源性,处于同一个进化分支上;而与日本青、金鱼、拟鲤、壁虎等的同源性较低。将此cDNA片段定向克隆到表达载体pMAL-c2x中构建重组表达质粒pMAL-GnRH,转化到大肠杆菌TB1中,0.3M IPTG诱导4 h后成功表达出与预期大小相符的约56 kD的融合蛋白。表明大肠...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
崔萍 于三科 罗德炎 王希良
为了克隆表达鼠疫耶尔森氏菌的YscF抗原基因,并对其免疫原性进行初步研究,将PCR扩增的YscF基因连接到pMD-18T载体,测序正确后再将YscF基因连接到表达载体PET32a,构建PET32a-YscF重组质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达;诱导表达蛋白采用Ni2+亲和层析法纯化,Western blot检测其免疫原性。结果显示,28 ku的PET32a-YscF融合蛋白能被兔抗鼠的多抗识别,说明表达产物具有良好的抗鼠疫抗原特异性。
关键词：
鼠疫耶尔森氏菌 YscF抗原 克隆表达
[期刊] 中国水产科学
[作者]
柳学周 徐永江 廖梅杰 潘传燕 王妍妍
采用RACE技术,在圆斑星鲽(Verasper variegatus)脑中克隆到3种GnRH基因的cDNA序列:cGnRH-Ⅱ、sGnRH和sbGnRH。每种GnRH都包括1个信号肽、1个Gly-Lys-Arg连接序列和1个GnRH相关肽。其中,cGnRH-Ⅱ的cDNA全长为568 bp,编码85个氨基酸,ORF为255 bp,5′UTR为141 bp,3′UTR为169 bp。sGnRH的cDNA全长为457 bp,编码90个氨基酸,ORF为270 bp,5′UTR为41 bp,3′UTR为143 bp。sbGnRH的cDNA全长为381 bp,编码98个氨基酸,ORF为294 bp,5′U...
关键词：
圆斑星鲽 GnRH 分子克隆 表达特性
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
马英 林顺权 高毅 张军 吕柳新 夏宁邵
将乙肝病毒表面抗原 (HBs Ag)基因与 Ca MV3 5 s启动子及 nos终止子构建植物表达载体 p1 3 0 1 HBs,直接法转入根癌农杆菌 EHA1 0 5 (Agrobacterium tumefaciens) ,以该菌株介导叶盘法转化番茄 ,得到抗潮霉素的再生植株 .抗性苗总 DNA经 PCR、Southern斑点杂交证实目的基因已整合到番茄基因组中 ,EILSA检测证明在番茄中正确表达了乙肝表面抗原蛋白 .
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
王保明 谭晓风
利用构建的油茶近成熟种子cDNA文库,分离鉴定了一条油茶亲环素基因的cDNA序列;该序列全长975bp(base pair),含有一个621bp的开放码框,编码207个氨基酸,将其命名为co-cyp(GenBank登录号:FJ377540)。该基因与其它物种的亲环素基因具有较高的同源性,结构分析表明该蛋白的二级结构以片层为主,并伴有α-螺旋、β转角和大量的无规则卷曲;其N端有一个强疏水性的信号肽序列,具有跨膜结构和较好的柔性;还具有N-连接糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点、酪氨酸激酶磷酸化位点、N-连接肉豆蔻酰位点、脯氨酸顺反异构酶标志序列、环孢菌素(CsA)结合位点(...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
陈凯 习丙文 滕涛 王亚冰 高金伟 梁利国 谢骏
促肾上腺皮质激素释放激素受体（ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｃｒｈｒ）是鱼类下丘脑–垂体–头肾调控轴上的重要应激调节因子。本研究通过ｃ Ｄｎａ末端快速扩增（ｒａｃｅ）技术成功克隆出团头鲂（ｍｅｇａｌｏｂｒａｍａ ａｍｂｌｙｃｅｐｈａｌａ）ｃｒｈｒ１ ｍ ｒｎａ全长序列，应用生物信息学方法对其序列特征进行解析；同时采用荧光定量ｐｃｒ技术分析了团头鲂ｃｒｈｒ１的组织分布图谱及外源性皮质醇注射模拟应激处理下团头鲂ｃｒｈｒ１ ｍ ｒｎａ的表达变化。研究结果表明，ｃｒｈｒ１ ｍ ｒｎａ序列开放阅读框（ｏｐｅｎ ｒｅａＤｉｎｇ ｆｒａｍｅ，ｏｒｆ）为１２．．．
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘新琼 颜华 王德彬
为建立表达含前S基因乙肝病毒表面抗原的细胞株,将笔者所在实验室构建的表达含前S基因乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的真核表达质粒共转染CHO/dhfr-细胞,通过筛选,获得可表达含前S基因乙肝病毒表面抗原的重组CHO细胞,然后进行亚克隆,用氨甲喋呤(MTX)加压选择,以ELISA法检测目的蛋白表达量,筛选获得稳定表达目的蛋白的细胞株,并对其进行特性鉴定。最终获得了C10和A10两株稳定高表达含前S基因乙肝病毒表面抗原的细胞株。
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