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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张元鹏 杨占娜 杨利 李兰 于晓明 杜露平 陈瑾 侯立婷 乔绪稳 侯继波 郑其升
[目的]本试验旨在分析乙型脑炎病毒(JEV)感染猪睾丸(ST)细胞和正常ST细胞miRNA差异表达谱,以探索miRNA在JEV感染过程中的作用及其调控机制。[方法]分别提取正常ST细胞和JEV感染8 h后的ST细胞总RNA,利用高通量测序技术检测分析ST细胞中的miRNA表达谱并进行差异分析。使用miRanda软件对表达差异显著miRNA的靶基因进行预测并对靶基因进行GO分析。选取6个显著性差异表达的miRNA通过RT-qPCR进行验证。[结果]与正常ST细胞相比,JEV感染后的ST细胞有112个差异表达miRNA,其中80个miRNA上调表达,32个miRNA下调表达。经RT-qPCR方法验证6个差异表达的miRNA结果与高通量测序结果一致。差异表达miRNA靶基因的生物学功能相对集中在细胞代谢、细胞黏附等生物过程。[结论]检测和分析JEV感染后猪睾丸细胞的miRNA表达谱,获得了大量的与JEV感染相关的miRNA表达谱数据,为揭示JEV感染生殖系统致病机制提供了有效的数据和理论基础。
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
沈红霞 韩秀杰 赵凡凡 张保新 余风艳 王晓杜
猪Sus scrofa domestica日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是引起母猪繁殖机能障碍的重要病原之一,其NS1蛋白参与病毒复制和组装、调节宿主免疫反应功能。提取猪日本乙型脑炎上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,扩增该病毒的NS1基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS1,转化大肠埃希菌Escherichia co1i BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组JEV-NS1蛋白,获得分子量大小为46 kDa的重组蛋白。为了提高表达量,JEV-NS1基因的958...
[期刊] 水产学报
[作者]
伊丽竹 徐镇 林蠡 涂加钢
为了探究microRNA(miRNA)对乌鳢水泡病毒(snakehead vesiculovirus, SHVV)感染月鳢细胞(striped snakehead cell, SSN-1)的影响,本研究对SHVV感染的SSN-1细胞及未感染的细胞进行miRNA高通量测序。分别用U6、β-actin和5S rRNA作为内参基因研究SHVV感染对细胞内22个高丰度(transcripts per million, TPM≥1 000) miRNA表达水平的影响,结果显示,U6基因作为内参时,SHVV感染对β-actin没有显著影响,但是5S rRNA显著上调表达,说明U6和β-actin基因适合作为内参基因研究SHVV感染对miRNA表达水平的影响。此外,我们研究了14种miRNA对SHVV增殖的影响。结果发现,miR-27a-3p、miR-26a-5p、miR-30e-3p等11种miRNA显著促进SHVV增殖,miR-150和miR-216b显著抑制SHVV增殖。进一步研究发现高丰度的miR-100-5p在SHVV感染SSN-1细胞早期上调表达,晚期下调表达。过表达miR-100-5p可以显著抑制SHVV的增殖,而抑制表达miR-100-5p可以显著促进SHVV的增殖。本研究为开发抗SHVV的核酸药物提供了理论基础。
[期刊] 中国卫生经济
[作者]
李仁鹏 张丽 徐爱强 宋立志 吕静静 颜丙玉 纪峰 刘甲野 房学强 王镇 朱大伟 张国杰 冯艺 肖作奎 庄贵华 张顺祥
目的:评价乙型肝炎(以下简称乙肝)病毒携带者、急慢性乙肝、乙肝所致肝硬化和肝癌病人的年经济负担。方法:从山东省社区人群和住院治疗的乙肝病毒感染住院病人中选取调查对象问卷调查,获取年费用信息,查阅住院病人病历登录本次住院费用。结果:社区人群非活动性HBsAg携带者、慢性HBsAg携带者、慢性乙肝、乙肝肝硬化的年经济负担为0.81万元、0.90万元、1.20万元、1.15万元和0.96万元;住院病人原发性肝癌、重型乙肝、肝硬化失代偿期、代偿期、慢性乙肝以及急性乙肝的年经济负担分别为37.72万元、13.81万元、15.67万元、14.34万元、12.74万元和6.67万元。结论:乙肝带来沉重的经济负担,需加大住院病人的医疗保险报销比例,积极防控乙肝病毒感染具有巨大的社会效益和经济效益。
关键词：
乙型病毒性肝炎 疾病经济负担 山东
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张秋婷 关如婷 潘俊慧 杨兴淼 谢盛达 余都 王学飞 曹瑞兵
[目的]为了探究日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）感染猪扁桃体的组织和细胞嗜性。[方法]本研究筛选JEV抗原、抗体均为阴性的健康商品仔猪3头，通过颈部皮下及静脉注射接种JEV NJ2008株，2×10~(7)TCID_(50)/头，对照仔猪注射生理盐水2 mL。饲养观察一周，期间采集鼻拭子、血液和扁桃体等组织样品。通过qPCR、组织切片免疫组化和免疫荧光等方法检测病毒。[结果]3头接毒仔猪体温均正常，试验仔猪7 d中均未观察到明显的临床症状。3头接种JEV NJ2008仔猪从接毒当天开始出现2 d的病毒血症，可从持续7 d采集的鼻腔拭子中检出JEV。JEV主要感染猪软腭扁桃体，攻毒仔猪的咽扁桃体、咽鼓管扁桃体、会咽扁桃体的免疫组化检测中未发现JEV阳性细胞。在软腭扁桃体中，JEV感染细胞主要分布于淋巴滤泡的周边和弥散淋巴组织中，JEV抗原阳性细胞多为形态不规则，细胞核较大，着色较淡，具有巨噬细胞或树突状细胞的特征。随后，通过CD11b、CD163和MHC II 细胞表面标志的检测，进一步鉴定JEV阳性细胞多为巨噬细胞或树突状细胞等抗原提呈细胞。[结论]本试验结果显示在JEV感染早期的1周内，仔猪扁桃体呈现持续性感染，其中JEV阳性细胞多为巨噬细胞或树突状细胞等抗原提呈细胞，这些结果为研究JEV在扁桃体中的持续感染机制奠定了基础。
关键词：
日本脑炎病毒 仔猪 扁桃体 细胞嗜性
[期刊] 西南农业学报
[作者]
叶茂 郭万柱 徐志文 王小玉 李云云
为了构建和筛选良好的猪乙型脑炎和猪细小病毒的核酸疫苗,并提高核酸疫苗的免疫效果,用重叠PCR法把PPV VP2和JEV E10连接,再将扩增的IFN-γ连入构建载体pcDNA.VEI使其共同表达。用脂质体将pcDNA.VEI介导入Vero细胞,通过间接免疫荧光法检测目的基因的体外表达。用pcDNA.VEI和不表达IFN-Κ的pcDNAZ.VE分别免疫Balb/c小鼠,同时设立PBS、猪细小病毒灭活疫苗、乙型脑炎弱毒疫苗和pcDNA3.1空白质粒免疫对照组。共免疫两次,间隔2周检测免疫指标。结果表明,通过鉴定核酸疫苗的构建达到了预期目标,并可在荧光显微镜下观察到了其转染的Vero细胞。该核酸疫苗...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
余风艳 韩秀杰 沈红霞 张保新 赵凡凡 王晓杜
提取猪日本乙型脑炎病毒(JEV)上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,扩增JEV-NS5基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS5,转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组JEV-NS5蛋白,获得分子质量为103 ku的重组蛋白.该蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占总菌体蛋白的35%以上,His-band Ni+纯化后,获得高纯度重组蛋白占总蛋白的比例达75%以上.以纯化的蛋白免疫小鼠,制备小鼠抗JEV-NS5抗体,抗体效价达到3×104,并能与病毒感染的样本反应,证明该蛋白具有较好的特异性.
[期刊] 西南农业学报
[作者]
卢冰霞 李斌 秦毅斌 赵武 梁家幸 韦超文 何颖 苏乾莲 梁保忠 李莹莹 姜佳佳 杨盛斌 黄伟坚
对广西猪JEV FC792株的E基因主要抗原域Ⅰ、Ⅱ基因(Ea基因)进行原核表达及抗原性鉴定,为猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)诊断抗原和基因工程疫苗的研制奠定基础。结果:成功构建广西猪JEV FC792株Ea基因的克隆重组质粒pMD18-T-Ea及表达重组质粒pET32a-Ea,经SDS-PAGE及Western blot鉴定表明,JEV FC792株Ea蛋白在Rosetta(DE3)菌中成功进行融合表达,表达出约58 KDa的融合蛋白;经抗原性鉴定表明,表达的融合蛋白Ea能与猪JEV阳性血清抗体发生特异性反应,融合蛋白Ea具有良好的JEV抗原性。
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵珊 林华 陈世界 杨苗 薛昌华 郝中香 王彬 文彩芳 颜其贵
为了更有效地保护野猪资源，评估其作为种质资源的安全性及人类驯养的风险性，采用Ｔａｑ Ｍａｎ荧光定量ＰＣＲ监测野猪乙型脑炎病毒的携带情况。结果显示，Ｔａｑ Ｍａｎ荧光定量ＰＣＲ敏感性是常规ＰＣＲ检测方法的１００倍，检测时间缩短了１／２。重复性试验中，批内及批间变异系数均低于２％。对４０份家养野猪血液样品进行检测，Ｔａｑ Ｍａｎ荧光定量ＰＣＲ的阳性检出率为１０％，国标（ＧＢ／Ｔ ２２３３３－２００８）中ＲＴ－ＰＣＲ的阳性检出率为５％，灵敏度显著提高。表明该方法可用于野猪乙型脑炎的实时监测和流行病学调查，同时也为野猪群乙型脑炎的净化奠定基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵珊 林华 陈世界 杨苗 薛昌华 郝中香 王彬 文彩芳 颜其贵
为了更有效地保护野猪资源,评估其作为种质资源的安全性及人类驯养的风险性,采用TaqMan荧光定量PCR监测野猪乙型脑炎病毒的携带情况。结果显示,TaqMan荧光定量PCR敏感性是常规PCR检测方法的100倍,检测时间缩短了1/2。重复性试验中,批内及批间变异系数均低于2%。对40份家养野猪血液样品进行检测,TaqMan荧光定量PCR的阳性检出率为10%,国标(GB/T223332008)中RTPCR的阳性检出率为5%,灵敏度显著提高。表明该方法可用于野猪乙型脑炎的实时监测和流行病学调查,同时也为野猪群乙型脑炎的净化奠定基础。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
郭艳娜 刘志远 孙彤彤 黄楠 赵锦华 刘清政 平继辉 周继勇
[目的]本试验旨在利用基因芯片测序技术分析宿主miRNA在调控流感病毒感染小鼠肺组织过程中的作用。[方法]应用低致病性H_7N_9亚型A/Anhui/1/2013流感病毒及PBS感染BALB/c小鼠,感染后3 d取小鼠肺组织分别利用转录组测序技术和miRNA芯片测序技术筛选差异表达mRNA和miRNA,并利用RT-qPCR验证差异miRNA。之后分别采用Targetscan、PITA及microRNAorg软件预测靶基因并结合转录组mRNA信息筛选候选miRNA的假定靶基因,最后利用Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes(KEGG)分析差异miRNA的生物学功能及其可能调控的信号通路。[结果]与PBS组相比,低致病性H_7N_9病毒感染组共筛选到265个差异表达miRNA,其中143个miRNA显著上调,122个miRNA显著下调。差异表达miRNA经RT-qPCR验证,10条候选miRNA的RT-qPCR结果与芯片结果有非常好的一致性。进一步KEGG分析表明,这些差异表达miRNA主要富集在Rap1、PI3K-Akt、Hippo、MAPK、Wnt、黏着斑、自噬等免疫相关信号通路中。结合差异mRNA信息进行miRNA-mRNA调控网络分析,显示主要有15条差异表达miRNA和31个差异靶基因富集到这些信号通路中。[结论]成功筛选到了低致病性H_7N_9感染小鼠肺组织后引起的差异表达miRNA,且RT-qPCR证明其与基因芯片测序结果表达趋势具有很好的一致性,为深入研究宿主miRNA在调控低致病性H_7N_9流感病毒与宿主相互作用的分子机制奠定了基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
禹乐乐 滕蔓 罗俊 迟佳琦 余祖华 柴书军 梁晓晓 张改平 王爱萍
为了解猪源乙型脑炎病毒(JEV)的全基因组结构及其分子进化规律,测定了3个JEV猪源分离株(BSF.ZZ-1、BSF.ZZ-3和CSF.XZ-2D)的全基因组序列,并对它们的氨基酸序列进行了分析。结果表明,CSF.XZ-2D全长为10 976 nt,而BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3全长均为10 977 nt,在后2个毒株基因组的10 701 nt位点处均有1个插入碱基"G"。BSF.ZZ-1、BSF.ZZ-3、CSF.XZ-2D与SA14株核苷酸和氨基酸同源性较高,核苷酸同源性都为99.4%,氨基酸同源性均为99.0%,与猪源分离株HW(HW1)、HWe(HW2)和SH0601的核苷酸与氨...
关键词：
猪 乙脑病毒 全基因组 系统进化分析
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王韦华 张旭 张彦明 邢福珊 徐彦召
【目的】分离鉴定乙型脑炎病毒(JEV),确定分离毒株的基因分型及其E区段氨基酸的序列特征。【方法】采用BHK-21细胞培养法,从猪脑组织标本中分离出1株病毒,对其进行细胞和免疫荧光试验,同时采用RT-PCR扩增并克隆该毒株的PrM、E区段核苷酸序列,利用PrM(456~695位)区核苷酸序列与36株参考序列进行基因分型分析,并对E区核苷酸序列与减毒活疫苗株SA-14-14-2株的相应序列进行比对,分析分离株和疫苗株氨基酸的同源性及关键结构域的差异。【结果】分离出的病毒经细胞病变和直接免疫荧光试验证实为乙脑病毒,命名为SX-BJ07;用该病毒感染BHK-21细胞,72 h后所有细胞均发生病变(C...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
李能秀 焦健 左雨霏 马忠梅 常意行 孟庆玲 才学鹏 乔军
【目的】分离和鉴定感染单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）小鼠巨噬细胞外泌体（Exosomes，Exos）并分析其miRNA表达谱，为揭示巨噬细胞Exos miRNA在LM感染中的调控机制奠定良好的研究基础。【方法】以未感染LM的巨噬细胞为对照组，感染LM的巨噬细胞为试验组，采用超速离心法分离提取巨噬细胞上清中的Exos，通过透射电镜、纳米颗粒追踪技术和Western blot对Exos形态、大小及表面标志分子特征进行鉴定。利用Illumina SE50测序平台对两组巨噬细胞ExosmiRNA进行Small RNA-seq测序，筛选出显著差异表达的miRNA。使用Targetscan、miRDB和miRWalk数据库对差异表达miRNA靶基因进行预测，并对差异miRNA靶基因进行GO和KEGG-Pathway功能富集分析。利用Cytoscape软件绘制前20位Hub基因的miRNA-mRNA调控网络图。【结果】Exos直径在30～150 nm之间，具有典型的双层膜结构，Exos表面标志分子CD9、CD63和TSG101呈阳性表达。高通量测序结果显示，与对照组相比，试验组Exos中共筛选出9个显著差异表达的miRNA，其中显著下调基因8个（mmu-miR-7a-5p、mmu-miR-365-2-5p、mmu-miR-122-5p、mmu-miR-122b-3p、mmu-let-7i-5p、mmu-miR-151-3p、mmu-miR-182-5p和mmu-miR-1198-5p），显著上调基因1个（mmu-miR-192-5p），共预测miRNA调控靶基因1064个。GO富集分析结果显示，差异miRNA靶基因主要富集在轴突形成、细胞连接组装、肌动蛋白结合和金属离子跨膜转运等过程；KEGG分析显示，靶基因显著富集在cGMP-PKG信号通路和FcγR介导的吞噬作用通路。【结论】感染LM的小鼠巨噬细胞ExosmiRNA表达谱发生了显著的改变，其调控的潜在靶基因主要参与感染和免疫反应等信号通路。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
向卫军 杨涛涛 李润成 余兴龙
为探寻湖南汨罗地区猪场蚊子携带乙型脑炎病毒(JEV)的情况,对该地区3个猪场蚊子开展JEV的病原学调查研究。从该地区3个种猪场采集约3 900只蚊子,用RT–PCR方法扩增JEV NS5基因,结果从40份样品中检出17份样品呈阳性。将阳性样品研磨液接种BHK–21细胞分离病毒,经3次传代后获得了1株JEV,将新分离株命名为HNML1株。根据JEV的E基因序列设计1对引物,用RT–PCR方法扩增HNML1株的E基因,并进行序列测定和同源性分析,结果表明,该E基因的核苷酸序列与减毒活疫苗株SA14–14–2相
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