为了鉴定乌鳢水泡病毒(SHVV)磷蛋白(P)的异构体并研究其在病毒增殖中的作用,本研究扩增了SHVV的P基因,构建了原核表达质粒pET32a-P,通过Ni-NTA亲和层析柱纯化His-P蛋白,免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,利用该抗体对SHVV的P蛋白异构体进行鉴定。进一步利用增强性绿色荧光蛋白(EGFP)研究了P蛋白异构体的亚细胞定位,并通过定量PCR(qRT-PCR)、Western blot及TCID_(50)研究了过表达P蛋白异构体对SHVV增殖的影响。结果显示,SHVV感染斑点叉尾鮰卵巢细胞(CCO)出现3条P蛋白带,进一步验证表明,其中2条带分别是P蛋白(又称P1)及其异构体P2。亚细胞定位实验发现P1和P2主要定位在细胞质,但是可以在核质中穿梭。在CCO细胞中过表达P1、P2均能促进SHVV增殖。因此,SHVV在感染过程中能产生P蛋白(P1)及其异构体P2,且P1和P2对SHVV增殖发挥重要作用。研究结果有助于阐明SHVV的致病机理以及弹状病毒P蛋白异构体的功能。

为研究L蛋白在乌鳢水泡病毒(snakehead vesiculovirus, SHVV)增殖过程中发挥的作用,扩增SHVV L基因的前900个碱基,将其克隆到载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET32a-L,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。设置不同温度、IPTG浓度及诱导时间,选择最佳的表达条件。通过NI-NTA亲和层析柱纯化蛋白,并利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。用Western blot鉴定抗体特异性,间接免疫荧光观察L蛋白在SHVV感染斑点叉尾鮰卵巢细胞(channel catfish ovary, CCO)中的定位情况。结果显示,纯化的L蛋白分子质量约42 ku,与预期大小相符。制备的L蛋白多克隆抗体可以与L蛋白发生特异性免疫反应,且L蛋白主要定位在细胞质,表明L蛋白多克隆抗体制备成功。

为了研究miR-130c-5p在乌鳢水泡病毒(snakehead vesiculovirus, SHVV)感染中潜在靶基因g的靶向关系以及对病毒复制的影响，本研究以斑点叉尾鮰卵巢(channel catfish ovary, CCO)为实验材料，通过实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)和免疫印迹(Western blot)技术测定SHVV不同感染时间和感染剂量条件下，病毒基因水平和蛋白水平以及miR-130c-5p变化情况。此外，将SHVV的g基因上miR-130c-5p对应的靶序列克隆到质粒pmirGLO，构建质粒pmirGLO-G用于双荧光素酶报告实验进行靶基因验证。结果显示，随着SHVV感染时间及剂量的不断增加，miR-130c-5p和g基因的表达水平都显著上调。进一步实验证明，miR-130c-5p类似物和pmirGLO-G质粒共转染可显著抑制荧光素酶活性强度，而转染miR-130c-5p抑制剂则明显上调了pmirGLO-G报告载体的荧光信号。此外，miR-130c-5p的过表达显著降低了病毒g基因的mRNA及蛋白表达，而抑制miR-130c-5p的表达则上调了g基因的mRNA及蛋白的表达水平。研究结果表明，miR-130c-5p通过靶向SHVV的g基因，引起G蛋白的降解，从而抑制SHVV的增殖。本研究结果为理解microRNA调控SHVV的致病机制提供了重要基础，为抗SHVV疫苗等药物的研发提供了理论支持。

为了探究microRNA(miRNA)对乌鳢水泡病毒(snakehead vesiculovirus, SHVV)感染月鳢细胞(striped snakehead cell, SSN-1)的影响,本研究对SHVV感染的SSN-1细胞及未感染的细胞进行miRNA高通量测序。分别用U6、β-actin和5S rRNA作为内参基因研究SHVV感染对细胞内22个高丰度(transcripts per million, TPM≥1 000) miRNA表达水平的影响,结果显示,U6基因作为内参时,SHVV感染对β-actin没有显著影响,但是5S rRNA显著上调表达,说明U6和β-actin基因适合作为内参基因研究SHVV感染对miRNA表达水平的影响。此外,我们研究了14种miRNA对SHVV增殖的影响。结果发现,miR-27a-3p、miR-26a-5p、miR-30e-3p等11种miRNA显著促进SHVV增殖,miR-150和miR-216b显著抑制SHVV增殖。进一步研究发现高丰度的miR-100-5p在SHVV感染SSN-1细胞早期上调表达,晚期下调表达。过表达miR-100-5p可以显著抑制SHVV的增殖,而抑制表达miR-100-5p可以显著促进SHVV的增殖。本研究为开发抗SHVV的核酸药物提供了理论基础。

利用ＲＴ－ＰＣＲ的方法从感染水稻矮缩病毒（ＲｉＣｅ ｄｗａＲｆ ｖｉＲｕｓ，Ｒｄｖ）的水稻中克隆该病毒的运动蛋白基因ｓ６和外壳蛋白基因ｓ８，通过ＧａＴｅｗａｙ系统进行原核表达，获得表达载体Ｐ ｄｅｓＴ１７－Ｐｎｓ６和Ｐ ｄｅｓＴ１７－Ｐ８，将表达载体转化ｅ．Ｃｏｌｉ ＲｏｓｅＴＴａ，经ｉＰＴＧ诱导表达后获得分子质量约为５９和４６ ｋｕ含Ｈｉｓ标签的融合蛋白．以诱导表达的目的蛋白为抗原，免疫注射新西兰大白兔制备多克隆抗体．结果表明，ｗｅｓＴｅＲｎ ｂｌｏＴ检测制备的Ｐｎｓ６和Ｐ８抗体可特异性检测Ｒｄｖ，间接ｅｌｉｓａ测定Ｐｎｓ６和Ｐ８抗体的效价均约为６ ４００倍，并建立了可靠、灵敏、特异的ｄｏＴ．．．

[目的]制备日本脑炎病毒prM蛋白的特异性单克隆抗体，对进一步了解prM的结构和功能、开发特异性检测方法以及JEV prM蛋白的功能研究奠定基础。[方法]将prM基因克隆至原核表达载体pET-32a，诱导表达并纯化prM重组蛋白，随后将其免疫小鼠，通过细胞融合和亚克隆得到分泌抗prM单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备腹水并进行效价测定，通过Western blot和IFA验证其特异性，并进行空斑中和试验测定其中和活性，利用原核表达多段截短体蛋白确定单克隆抗体抗原表位并进行保守性分析，将其初步应用于感染检测及亚细胞定位分析。[结果]经细胞融合和三次亚克隆后成功获得1株能稳定分泌抗prM单克隆抗体的细胞株，命名为4H6，所制备的腹水效价可达到1∶1638400，经鉴定该抗体重链属于IgG2b，轻链为κ型。Western blot以及IFA试验均证明该抗体具有良好的特异性。空斑减少中和试验显示4H6不具备中和活性。通过表达截短蛋白鉴定出4H6所识别的抗原表位位于³⁰GENRCWVRAIDVGYMC⁴⁵，结合生物信息学分析发现该表位位于prM蛋白表面且在JEV不同毒株之间高度保守，有利于抗原抗体的直接接触。并成功将4H6初步应用于JEV感染检测及prM蛋白亚细胞定位分析。[结论] 成功制备1种高效且特异性的JEV prM蛋白单克隆抗体，抗原表位识别区位于pr，为分析prM蛋白在病毒复制过程中的生物学功能以及与其他病毒蛋白（如E蛋白或宿主分子）之间的相互作用提供有效工具。

使用反相高效液相色谱和二极阵列检测及大气压化学电离质谱技术对玉米蛋白粉中叶黄素、玉米黄质和隐黄质及其主要顺式异构体进行分离和鉴定。以体积分数95%的乙醇和四氢呋喃按体积比1∶1混合为提取溶剂,采用Carotenoid C30色谱柱(250.0 mm×4.6 mm,5μm)分离,甲醇和丙酮为流动相,流速0.5 mL/min,检测波长450nm,采用DAD和APcI-MS技术对叶黄素、玉米黄质和隐黄质的主要顺式异构体进行鉴定。结果表明:叶黄素、玉米黄质和隐黄质及这3种色素的异构体在60 min内较好分离,其质量浓度为5.0~150.0、2.7~80.1和0.6~18.0μg/mL时与峰面积线性关系...

以乌鳢(Ophiocephalus argus)肌原纤维蛋白为研究对象,考察当归(Angelica sinensis)粉或当归浸提液对乌鳢肌原纤维蛋白微观结构的影响,并探讨其作用机制。扫描电镜及SDS-PAGE结果表明,加入1%~2%的当归时,乌鳢肌原纤维蛋白的微观结构变得更加致密,有利于形成更为致密的三维网络结构,提高鱼糜制品的品质;但大量(3%~5%)当归的添加会使原本致密的蛋白网络结构变得松散。傅里叶红外光谱和圆二色谱实验表明,随着当归粉或者当归浸提液含量的增加,乌鳢肌原纤维蛋白中二级结构α-螺旋和β-转角的总相对含量会先增加后减少,而β-转角和无规卷曲总的相对含量会先降低再升高。

通过原核表达的方法得到血清4型禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白;根据GenBank中血清4型禽腺病毒六邻体蛋白的基因序列,设计一对特异性引物,利用普通PCR方法扩增得到hexon基因的全长序列。将PCR扩增得到的血清4型禽腺病毒六邻体基因片段,在其两端插入酶切位点后克隆至载体pMD18T中,经PCR鉴定和测序分析正确后,与原核表达载体pET-32 a进行连接,构建pET-32 a-hexon原核表达载体,并对其进行双酶切和测序鉴定。将构建成功的表达载体转化至BL21(DE3)中,用1 mmol/L的IPTG进行诱导表达,对得到的重组蛋白进行SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定;经双酶切鉴定和测序鉴定,pET-32a-hexon原核表达载体构建成功,插入的六邻体蛋白基因片段大小为2 814 bp,在1 mmol/L浓度IPTG诱导3 h时重组蛋白表达量最高,且重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。SDS-PAGE分析结果显示,融合蛋白分子量为118 ku。免疫印迹分析结果显示,融合蛋白可被抗FAdV-4的血清和HIS标签抗体特异性识别;成功表达了血清4型禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白,且得到的重组蛋白具有良好的反应原性,可用于血清4型禽腺病毒的进一步研究中,为血清4型禽腺病毒病的预防和治疗奠定了良好的基础。

【目的】由新型鹅星状病毒（novel goose astrovirus, nGAstV）引起的雏鹅痛风病对我国养鹅业造成了重大经济损失。通过构建nGAstV纳米抗体（nanobody, Nb）噬菌体展示文库，获得识别nGAstV ORF2蛋白的特异性Nb，可为建立nGAstV抗体检测方法及研究nGAstV ORF2蛋白结构和功能奠定基础。【方法】使用蔗糖密度梯度离心方法纯化在LMH细胞中增殖的nGAstV,RT-PCR鉴定nGAstV并通过细胞病变测定nGAstV滴度。用0.06%甲醛溶液灭活纯化的nGAstV作为免疫原，免疫两周岁羊驼。首次免疫时用灭活纯化的nGAstV与等量弗氏完全佐剂乳化后免疫，第2—5次免疫用灭活纯化的nGAstV与等量弗氏不完全佐剂乳化。每间隔两周免疫一次，每次免疫剂量均为50μg。第5次免疫14 d后，通过间接ELISA方法测定羊驼血清中针对nGAstV的IgG抗体效价。待IgG抗体效价达到构建噬菌体抗体展示文库标准时，分离羊驼外周血淋巴细胞（peripheral blood lymphocyte, PBL），然后提取PBL总RNA将其反转录为cDNA，利用巢氏PCR方法扩增重链抗体重链可变区（variable domain of the heavy chain of heavy chain antibodies, VHH）基因，将其构建至pComb噬菌体载体并结合噬菌体展示技术构建nGAstV Nb噬菌体展示文库，计算该文库库容量并分析其多样性。nGAstV作为靶抗原，通过三轮富集淘选初步获得与nGAstV反应的重组噬菌体Nb阳性克隆，将其克隆至pcDNA3.1-Fc真核表达载体并进行测序分析，将测序成功且序列不同的质粒转染至HEK-293F细胞中表达，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定表达情况。以nGAstV为靶标抗原，利用间接ELISA方法和Western blot试验对表达成功的Nb进行特异性、反应活性验证，并以nGAstV ORF2蛋白为靶标抗原，利用间接ELISA方法对Nb进行亲和力验证，获得生物学活性较好的Nb。【结果】RT-PCR结果显示，nGAstV增殖成功；Reed-Muench法分析nGAstV滴度达4.38 Log_(10)TCID_(50)/mL。羊驼经5次免疫nGAstV后，通过间接ELISA方法测得其血清中针对nGAstV的抗体效价达到1:64 000；利用巢氏PCR方法扩增出VHH并成功构建库容量为3.8×10~8 CFU/mL的nGAstV Nb噬菌体展示文库；遗传进化树分析显示，该噬菌体Nb库多样性良好。三轮富集淘选后，初步获得39株与nGAstV反应的重组噬菌体纳米抗体阳性克隆，其中有25株序列不同；SDS-PAGE鉴定结果显示，共有10株Nb在HEK-293F细胞中表达成功。通过ELISA、Western blot验证进一步获得8株与nGAstV ORF2蛋白特异性反应的Nb，且1株Nb生物学活性最好。【结论】首次筛选到与nGAstV ORF2蛋白特异性反应的Nb，为nGAstV的基础研究和检测方法提供材料。

【背景】非洲猪瘟（ASF）于2018年8月在中国首次出现，对养猪业造成了巨大危害，损失惨重。目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF，于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段。【目的】制备非洲猪瘟病毒（ASFV）特异性单克隆抗体，建立ASF快速特异性的检测方法。为ASF的检测和防控提供借鉴技术手段。【方法】构建表达载体pET-28a-P30，通过原核表达系统获得ASFV P30重组蛋白，以纯化的P30蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，经过细胞融合和细胞亚克隆制备出ASFV P30蛋白特异性杂交瘤细胞株；对P30蛋白进行截短表达，利用Western Blot和间接酶联免疫吸附试验（iELISA）鉴定单克隆抗体所对应的抗原表位；并利用制备的单克隆抗体建立非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测方法。【结果】通过双酶切和PCR验证，结果显示构建出重组载体pET-28a-P30，经测序其序列未发生突变；IPTG诱导后，P30重组蛋白主要表达在包涵体中，分子量约为33 kD。纯化的P30蛋白与弗氏佐剂1:1混合免疫小鼠，3次免疫后，小鼠血清效价达到1:102 400，说明表达的蛋白具有良好的免疫原性。经细胞融合和亚克隆，获得8株P30蛋白特异性杂交瘤细胞，Western Blot和间接免疫荧光试验（IFA）检测获得的8株单抗均具有良好的反应性。叠加试验显示8株单克隆抗体均针对相同的抗原位点；截短表达P30蛋白不同片段，选取制备的2-12B单克隆抗体与不同的截短P30蛋白反应，显示单克隆抗体的抗原表位区为187—194aa。利用2-12B单克隆抗体并经过条件优化，成功建立了ASF阻断ELISA抗体检测方法，检测了190份临床样品，并与商品化非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒进行对比，两方法阳性符合率为90.91%，总符合率为96.32%。【结论】本研究成功获得ASFV P30蛋白，经过iELISA、Western Blot和IFA筛选出反应性良好的特异性单克隆抗体8株，抗原识别表位区为187—194aa。并利用制备的单克隆抗体建立了特异性高，敏感性好的ASFV阻断ELISA抗体检测方法，为ASF的检测及其防控提供了手段和支撑。

应用RACE-PCR方法克隆并鉴定了乌鳢免疫球蛋白M(i mmunoglobulin M,Ig M)重链(H)和免疫球蛋白轻链(L)全长cDNA。乌鳢IgH cDNA全长1 912个核苷酸(nt),包含1 797 nt的开放阅读框,编码598个氨基酸(aa)。IgH恒定区(CH)均包含1对保守的半胱氨酸残基形成链内二硫键,其中CH1区氨基末端存在保守的半胱氨酸残基与轻链形成链间二硫键,4个推测的N-糖基化位点(NXT和NXS)则分别位于CH1、CH2和CH4。序列比对发现乌鳢IgHCH1与CH2交界处氨基酸序列的插入使铰链区肽段较其他硬骨鱼IgH长,此外IgH CH4区羧基末端参与单体间聚合的...

为了鉴定CyHV-2的主要免疫原性蛋白，本研究用分离的CyHV-2-YC-1分离株感染异育银鲫尾鳍细胞系（GiCF），用蔗糖密度梯度超速离心法对细胞感染液中的CyHV-2进行纯化，纯化后的CyHV-2病毒免疫小鼠制备抗CyHV-2多克隆抗体。纯化的病毒颗粒经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色后，用抗CyHV-2多克隆抗体进行Western blotting分析和质谱鉴定。结果显示，透射电镜观察下发现50%～66%的蔗糖梯度多见完整囊膜包裹的CyHV-2病毒颗粒，也有少量囊膜破损的病毒颗粒。Western blotting结果显示，抗CyHV-2多克隆抗体与多种病毒蛋白具有特异性免疫反应，质谱鉴定显示，其中8种主要免疫原性蛋白分别是ORF92、ORF115、ORF25、ORF57、ORF66、ORF72、ORF131和ORF132。研究表明，通过蔗糖密度梯度超速离心法提纯CyHV-2病毒颗粒后，本研究制备的抗CyHV-2多克隆抗体能够特异性识别CyHV-2病毒的主要免疫原性蛋白。本研究将为CyHV-2免疫学检测方法的建立以及疫苗的研制提供更多的候选抗原。

为获得具有免疫原性的FMDV VP1蛋白,以O型FMDV重组质粒PMD18T-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDVVP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体,命名为pET-VP1,经PCR和测序鉴定后,用IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析。结果显示,在分子量约为45 ku处有1条明显的蛋白条带,且能被口蹄疫阳性血清识别,表达产物通过包涵体纯化后用透析法复性;ELISA检测结果显示,所复性的蛋白具有较高的活性。结果表明,FMDV VP1蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为开发诊断制剂和疫苗的研制打下基础...