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[期刊] 中国农业科学
[作者]
迟良 李兰 潘庆杰 刘焕奇
【目的】克隆乌骨鸡黑色素皮质激素受体-1(melanocortin 1-receptor,MC1R)基因,并对其进行生物学分析和原核表达。【方法】采集乌骨鸡的肌肉组织,提取其总RNA,根据GenBank上公布的原鸡(Gallus gullus)MC1R基因序列设计引物,利用反转录RT-PCR克隆乌骨鸡MC1R基因,对其进行生物学分析,并构建原核表达载体pET32a-MC1R,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。【结果】乌骨鸡MC1R序列由945个碱基组成,编码314个氨基酸。成功构建了重组质粒pET32a-MC1R的原核表达系统,并且体外诱导获得了MC1R蛋白。【结论】成功克隆了乌骨鸡MC...
关键词：
乌骨鸡 黑色素 MC1R 原核表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
迟良 邹明 孙晓凤 刘焕奇
采用RT-PCR方法从乌骨鸡皮肤中克隆出黑色素主效基因黑色素皮质激素受体(Melanocortin1-receptorMC1R)基因,长度为945bp,与普通白鸡比对其同源性为99.6%。以pEGFP-N1为基础,将从测序载体pMD-18T-MC1R上使用EcoR I和Sal I切下的MC1R连接到同样酶切的pEGFP-N1,构建pEGFP-N1-MC1R真核表达载体,为以后转基因动物的制备打下了基础。
关键词：
乌骨鸡 MC1R 真核表达载体
[期刊] 西南农业学报
[作者]
李青芝 陈叶雨 吴晓雲 刘亚 赖见生 李华 杨焕超 宋明江 龚全 林珏
【目的】糖皮质激素受体(GR)参与了机体渗透调节、应激和免疫调节等多种生物学过程。因此，对GR表达特征的分析有利于揭示其在鱼类抗应激反应过程中的功能。【方法】以长江鲟转录组测序得到的Unigene序列作为基础，获得了GR的cDNA序列，同时研究了GR基因在各个组织及饥饿胁迫下的表达情况。【结果】GR基因开放阅读框为2316 bp，编码771个氨基酸，包含保守的锌指结构域和激素受体配体结合域，及鱼类特有的9-aa插入序列WRARQNMDG。GR在长江鲟各组织中广泛分布，其中，免疫器官脾脏、肝脏和鳃组织中表达量较高，在心脏和大脑组织中也有较高的表达水平。饥饿条件下，肝脏中GR相对表达量随饥饿时间的增加而逐渐上升，在饥饿7和14 d后，其表达量均显著高于对照组；肠道中GR在饥饿第7天表达量出现峰值，显著高于第0天(P<0.05)。复投喂后，肠道和肝脏中GR表达量恢复到了对照组水平。【结论】本研究表明GR参与了长江鲟对抗饥饿胁迫的应激反应过程。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
陈凯 习丙文 滕涛 王亚冰 高金伟 梁利国 谢骏
促肾上腺皮质激素释放激素受体（ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｃｒｈｒ）是鱼类下丘脑–垂体–头肾调控轴上的重要应激调节因子。本研究通过ｃ Ｄｎａ末端快速扩增（ｒａｃｅ）技术成功克隆出团头鲂（ｍｅｇａｌｏｂｒａｍａ ａｍｂｌｙｃｅｐｈａｌａ）ｃｒｈｒ１ ｍ ｒｎａ全长序列，应用生物信息学方法对其序列特征进行解析；同时采用荧光定量ｐｃｒ技术分析了团头鲂ｃｒｈｒ１的组织分布图谱及外源性皮质醇注射模拟应激处理下团头鲂ｃｒｈｒ１ ｍ ｒｎａ的表达变化。研究结果表明，ｃｒｈｒ１ ｍ ｒｎａ序列开放阅读框（ｏｐｅｎ ｒｅａＤｉｎｇ ｆｒａｍｅ，ｏｒｆ）为１２．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
郑嫩珠 辛清武 朱志明 缪中纬 李丽 刘凤辉 黄勤楼
【目的】克隆白绒乌鸡小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associaated transcription factor,MITF)基因序列,研究MITF基因在白绒乌鸡各组织中的表达,探索其对白绒乌鸡体内黑色素沉积的影响,为深入研究乌鸡体内黑色素沉积的内在调控机制奠定理论基础。【方法】以150日龄健康的白绒乌鸡为研究对象,采用简并引物和巢式PCR方法从白绒乌鸡皮肤组织中克隆MITF基因c DNA序列,通过DNAStar、Clustal X、Bio Edit和MEGA4.0等软件对获得的序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR法和紫外分光光度法分别研究白绒乌鸡各组织MITF...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
徐永江 朱学武 柳学周 史学营 史宝 王滨 李斌
为研究黑色素富集激素基因(MCH)表达调控与半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)无眼侧黑化性状的关系,通过分子克隆获得了半滑舌鳎pMCH2,通过NCBI获得了pMCH1 cDNA序列,分析了pMCH mRNA的组织表达特性,探索了脑垂体和皮肤中的p MCH mRNA表达与无眼侧黑化程度的关系。结果显示,pMCH1 cDNA序列长476 bp,编码134个氨基酸,与鲽形目、鲤形目和鲈形目鱼类的pMCH1氨基酸聚为1个进化分支。pMCH2 cDNA序列全长为626 bp,编码147个氨基酸
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
谢子正 韩召军
利用RACE技术,根据已有的三化螟转录组数据,设计特异引物对三化螟的蜕皮激素受体(EcR)和超气门蛋白(USP)基因进行克隆,获得了三化螟EcR和USP基因的全长序列。EcR基因全长2857bp,氨基酸序列包括545个氨基酸。USP基因全长共2082bp,氨基酸序列包括408个氨基酸。序列比对后发现,三化螟EcR和USP基因的氨基酸序列与已报道的鳞翅目昆虫EcR和USP基因的氨基酸序列具有很高的同源性,其中与二化螟的相似性分别达到94%和97%。序列分析表明,三化螟EcR和USP序列具有昆虫EcR和USP基因的特征结构:DNA结合域和2个锌指结构。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
赵敏蝶 刘杰 赵茹茜
[目的]本文旨在预测和筛选靶向调控鸡糖皮质激素受体（Glucocorticoid Receptor， GR）表达的microRNAs。[方法]用TargetScan、PicTar和miRDB三种软件分别预测靶向鸡GR 3'UTR microRNAs并取交集；构建包含鸡GR 3'UTR的重组质粒及突变质粒，通过双荧光素酶实验鉴定microRNA和鸡GR 3'UTR的靶向性；用TargetScan和miRDB两种软件分别预测候选microRNAs的靶基因，用DAVID软件对预测出的共同靶基因进行GO功能分析；Western blot检测分别过表达候选microRNAs对鸡DF1细胞 GR蛋白表达的影响。[结果]miR124-3p、miR142-3p、miR204/211、miR183、miR18-5p和miR181a/181b是三种软件预测靶向GR 3'UTR的交集microRNA；双荧光素酶实验的结果表明miR142-3p、miR204/211和miR18-5p靶向结合GR 3'UTR；两种软件预测三个候选microRNA的靶基因中都有GR且富集分子功能不同；在DF1细胞中过表达三个候选microRNA后，miR142-3p和miR204/211显著降低GR蛋白水平的表达（P < 0.05）。[结论] miR142-3p、miR204/211和miR18-5p靶向结合鸡GR 3'UTR且miR142-3p和miR204/21可以降低鸡DF1细胞中GR蛋白的表达水平。
关键词：
鸡 糖皮质激素受体 microRNA
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘萍 马晓霞 周小凯 马鹏 常秋燕 李林杰 李凌浩 马忠仁
为了研究流产衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)的免疫原性,建立快速有效的流产衣原体抗体检测方法,根据Gen Bank中公布的流产衣原体基因组序列,设计并合成了流产衣原体CPAF蛋白编码基因的特异性引物,以流产衣原体标准菌株基因组为模板,经PCR扩增获得长度为1 809 bp目的基因片段;对获得的目的基因进行测序,并用生物信息学软件进行预测分析;再将该片段插入原核表达载体p ET-30a中,经双酶切、测序鉴定;构建成功的表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG对目的蛋白进行诱导表达,通过对诱导条件的优化,确定诱导表达的最佳条件,表达产物用SDS-PAGE和Western Blot检测。结果显示,成功克隆流产衣原体CPAF蛋白的编码基因,该编码产物可能是定位于宿主细胞质中的一种衣原体分泌性蛋白酶,分子内具有多个可能的抗原表位;重组表达质粒经IPTG诱导后,表达分子质量为67.6 ku的CPAF蛋白,该重组蛋白能与抗His-tag单克隆抗体以及流产衣原体阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。结果表明,以大肠杆菌表达系统重组表达的流产衣原体CPAF蛋白具有良好的免疫原性,可作为动物流产衣原体病的血清学诊断及亚单位疫苗研究的候选抗原。
[期刊] 水产学报
[作者]
陈凯 习丙文 滕涛 秦婷 潘良坤 谢骏
为了解团头鲂糖皮质激素受体(GR)在应激反应中的调控机制,本研究以皮质醇注射模拟应激事件,采集组织样品,常规检测血糖、血清皮质醇水平;利用荧光定量PCR检测了gr在不同组织中的表达丰度及其参与调控的功能基因的表达变化;并通过常规石蜡切片开展了组织病理学研究。结果显示,gr1在脾脏、鳃、头肾等组织中有较高的表达量,gr2则在肝、垂体、肠等组织中具有较高的表达丰度。应激恢复过程中,下丘脑gr1表达量存在波动,gr2在0 h表达显著上调,gr1/gr2值逐渐增大;垂体中gr1和gr2均呈现先升后降的趋势,gr1/gr2值在2 h达到峰值水平;头肾中gr1表达量有波动,而gr2在0 h和2 h的表达量显著低于其他检测点的表达量,gr1/gr2值逐渐减小;肝脏中gr1的表达量在0 h和2 h的表达量显著高于其他检测点,gr2表达有上下波动的现象,gr1/gr2值有减小的趋势,而pepck表达则出现了显著上调,在2 h达到峰值;皮肤中gr1先升高后降低,gr2在0 h和2 h的表达量显著低于其他检测点,gr1/gr2值在2～8 h维持在较大值,而occ表达呈现先增加后降低的变化趋势;鳃中gr1与gr2均在2 h时发生了显著上调,gr1/gr2值在2～8 h维持在较大值,occ表达峰值出现在2 h。组织学研究显示鳃丝有增生现象,肾间组织中类淋巴细胞增多,其他所检视组织无明显病理改变。应激反应过程中gr在不同组织不同亚型间存在不同的表达变化,以及和不同组织器官中相关功能基因的相关性显示了GR在相关调控中的复杂性,而组织学研究结果则表明了应激反应存在诱发病理变化的风险。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
张晓燕 李健 刘萍 陈萍 孙铭 葛红星
通过简并引物扩增及Smart TM Race技术,首次克隆了三疣梭子蟹Portunus trituberculatus蜕皮激素受体EcR基因cDNA全长序列。该基因全长2 996bp,编码一个由503个氨基酸组成的多肽,预测理论等电点pI为7.33,分子量大小为55.69kDa。同源性及系统进化分析表明,三疣梭子蟹EcR基因与青蟹、拟穴青蟹、大西洋招潮蟹、陆地蟹、美洲螯虾、褐虾、日本对虾的同源性分别为94%、90%、88%、84%、82%、73%、66%。荧光定量RT-PCR结果表明,EcR在肝胰腺、卵巢、肌肉、眼柄、鳃和心脏中均有分布,在肝胰腺中表达量最高,在心脏中最低。高盐(45)胁迫下,...
[期刊] 水产学报
[作者]
宫磊 张亦陈 孙妍 刘逸尘 耿绪云 孙金生
蜕皮激素受体(ecdysteroid receptor,EcR)介导调控甲壳动物蜕皮生长、附肢再生等重要生命活动。为了解EcR在人工控制甲壳动物的繁殖和生长中的作用,采用RACE方法结合同源克隆技术,首次从中华绒螯蟹Y-器官中克隆得到蜕皮激素受体基因全长cDNA序列(Ers-EcR,登录号:KF736985),并进行了结构解析和组织表达分析。结果发现,Ers-EcR编码基因全长2 176 bp,开放阅读框为1 638 bp,编码545个氨基酸,具有DNA结合域(DBD)和配体结合域(LBD)等典型的核受体超家族结构域,但不具有信号肽结构。其中,DBD含有8个保守的Cys残基,可以形成2个锌指结...
关键词：
中华绒螯蟹 蜕皮激素受体 克隆 表达
[期刊] 中国水产科学
[作者]
廖盛臣 陈凯 习丙文 秦婷 潘良坤 谢骏
黑素皮质素3型受体(MC3R)系统与动物摄食行为以及能量调控密切相关。为丰富鱼类MC3R相关基础研究,探索鱼类摄食行为与能量调控机制,本研究克隆了团头鲂(Megalobrama amblycephala)mc3r基因,采用分子生物信息学和相对荧光定量PCR方法分别对氨基酸序列保守结构域、组织表达分布和禁食条件下的表达变化等开展分析研究。结果显示,团头鲂mc3r基因编码区全长984 bp,编码327个氨基酸,与现有报道的MC3R氨基酸序列高度相似,具有典型的7次跨膜结构域。组织表达图谱分析表明,mc3rmRNA在下丘脑、垂体、肝脏和卵巢有相对较高的表达。禁食试验结果显示,下丘脑和垂体中的转录变化与周期性摄食信号相关,其中下丘脑mc3r mRNA在禁食72 h和14 d的表达显著上调(P<0.05),而血糖水平显著低于对照组(P<0.05)。综合本研究结果表明,MC3R在鲤科鱼类中具有高度相似的氨基酸序列和结构域;在组织中的转录表达变化与食物摄取有明显相关性,对调控鱼体摄食行为和能量代谢具有重要作用。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李创举 岳华梅 叶欢 杨晓鸽 单喜双
【目的】克隆中华鲟(Acipenser sinesis)促甲状腺激素β亚基(TSHβ)基因,分析其序列特征和进化特征,研究其在中华鲟中的组织表达特征和不同年龄垂体中的差异表达,为中华鲟生长发育调控研究提供基础数据。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE),克隆中华鲟TSHβ,对其cDNA序列及其推导的氨基酸序列进行序列特征分析和系统发生分析;采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,对TSHβ-mRNA在中华鲟肝、心、脾、性腺、肠、垂体、下丘脑、中脑、端脑、小脑和延脑等组织中的表达状况,以及在1,3,5龄中华鲟个体垂体中的表达差异进行研...
关键词：
中华鲟 TSHβ 基因克隆 基因表达
[期刊] 中国水产科学
[作者]
金舒博 王宁 乔慧 傅洪拓 吴滟 龚永生 蒋速飞 熊贻伟
本研究首次克隆了青虾(Macrobrachium nipponense)高血糖激素(crustacean hyperglycemic homone,CHH)基因全长cDNA序列,并使用荧光定量PCR技术首次检测了CHH基因在青虾不同组织中的表达。青虾CHH基因cDNA全长1 017 bp,包括241 bp的5′UTR,408 bp的开放阅读框(ORF),355 bp的3′UTR,开放阅读框编码135个氨基酸。成熟肽包含6个CHH家族中位置保守的Cys残基。青虾CHH成熟肽C端为GK,确定为ES型CHH基因。蛋白相似度比对显示,所分离的青虾CHH被归为CHH家族I型肽。系统进化树分析表明,青虾C...
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