硬脂酰－酰基载体蛋白脱饱和酶是植物脂肪酸合成代谢的关键酶，直接调节膜脂和贮脂中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例。本研究通过ＲＴ－ＰＣＲ及ＲＡＣＥ技术，克隆乌桕硬脂酰－酰基载体蛋白脱饱和酶（ＳＳＳＡＤ）的ＣＤＮＡ全长序列。结果显示，该序列包含１个１１９１ ｂＰ的完整的开放阅读框（ＧＥＮｂＡＮｋ登录号为ＥＦ０７９６５５），编码３９６个氨基酸，含３３个氨基酸的叶绿体转移肽。其成熟肽含有３６３个氨基酸，推测其分子量为４１．５ ｋＤＡ，等电点为５．４２。同源性分析及同源建模数据显示ＳＳＳＡＤ和其它物种的ＳＡＤ有较高的同源性，含有１个保守结构域。构建原核表达载体ＰＭＡＬ－ＳＳＳＡＤ，转入大肠杆菌ＤＨ５α，并．．．

采用生物信息学方法对已在GenBank上注册的木薯、木油桐、蓖麻、麻风树、油桐和天山雪莲的△9硬脂酰-ACP脱饱和酶(Stearoyl-ACP desaturase,SAD)核酸序列以及推导的氨基酸序列、组成成分、导肽、跨膜拓扑结构、疏水性、亲水性、蛋白质二级结构与功能域及三维结构进行分析预测和推断.结果表明:木薯、木油桐、蓖麻、麻风树、油桐和天山雪莲的SAD核酸序列以及推导的氨基酸序列、组成成分均比较一致;木薯SAD存在叶绿体转运肽,天山雪莲SAD存在线粒体目标肽,均无跨膜结构;α-螺旋和无规卷曲是该蛋白质二级结构的主要结构元件,β-转角和延伸链散布于整个蛋白质中,只有一个功能结构域位于第6...

【目的】对芝麻△9硬脂酰-ACP脱饱和酶基因SiSAD(△9 stearoyl acyl-carrier-protein desaturase)进行克隆与表达分析,并转入拟南芥,探究其在油酸合成过程中的作用,为芝麻油酸含量的遗传改良提供分子基础。【方法】提取中芝13叶片的总RNA,反转录为cDNA。根据芝麻基因组数据库中的SiSAD序列信息(序列号为SIN_1008977)设计引物,以cDNA为模板,通过RT-PCR克隆获得SiSAD编码区序列,并与参考基因组序列进行比较。利用InterPro进行保守结构域分析,获得SiSAD蛋白的保守结构域。利用BLAST对SiSAD蛋白进行同源对比,获得SiSAD的同源蛋白质。采用邻接法构建系统进化树,获得芝麻SAD蛋白与橄榄、牵牛花、蓖麻、莴苣、葡萄、柑橘、拟南芥等植物SAD蛋白的亲缘关系。通过荧光定量PCR检测SiSAD在2个芝麻品种中芝33和中丰芝一号的根、茎、叶、蕾和种子中的相对表达量,分析SiSAD的表达特异性。将SiSAD连接过表达载体,通过农杆菌介导法转化野生型拟南芥(Col-0),筛选阳性后代,对T3代转基因和野生型的拟南芥种子中硬脂酸和油酸相对含量进行测定,分析SiSAD的功能。【结果】成功获得SiSAD的编码区序列,与参考基因组序列一致,全长为1 152 bp,编码383个氨基酸,SiSAD蛋白的分子量为43 kD,等电点为6.18。发现SiSAD蛋白含有一个保守结构域,属于脂肪酸去饱和酶家族成员,与其他植物的SAD蛋白质序列的同源性较高,暗示SiSAD在不同物种中的功能可能比较保守。系统进化分析显示,芝麻SAD蛋白与牵牛花和橄榄的SAD蛋白处于同一分支,进化关系较近,与蓖麻、拟南芥、柑橘的SAD蛋白亲缘关系较远。荧光定量PCR结果表明,SiSAD在芝麻种子中的表达量远远高于其他组织,有显著的组织特异性。成功构建了SiSAD的过表达载体,通过农杆菌介导法转化拟南芥,结果表明SiSAD成功导入拟南芥中,而且转录水平很高。对T3代转基因拟南芥种子中硬脂酸和油酸的相对含量分析表明,与野生型拟南芥比较,3个转SiSAD拟南芥株系中硬脂酸(C18:0)含量分别降低了3.0%、4.8%和6.1%,而油酸(C18:1)含量分别升高了2.8%、4.3%和7.8%,平均升高4.97%。【结论】克隆获得芝麻SiSAD的全长cDNA序列,鉴定了SiSAD的功能,发现SiSAD在油酸合成代谢过程中正向增加油酸含量,可应用于高油酸芝麻新品种培育。

硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-CoA desaturates, SCD)是单不饱和脂肪酸合成的关键限速酶,它在调节肝脏脂肪生成、脂肪酸代谢和脂质氧化方面发挥着重要作用。在本研究中,利用RACE技术克隆了吉富罗非鱼(Oreochromisniloticus)的完整scdcDNA序列,qRT-PCR分析了组织表达特点。为了验证scd基因的功能,利用CRISPR/Cas9技术构建scd基因敲除斑马鱼模型,研究了F3突变体的表型和基因表达变化,并结合高脂饲料实验验证了scd基因缺失后斑马鱼脂代谢的调控机制。结果显示,吉富罗非鱼scdcDNA序列全长1333bp,其中包括173 bp、1008 bp、152 bp的5'非编码区、开放阅读框和3′非编码区,编码335个氨基酸。scd基因在雄性和雌性罗非鱼的各组织中都有表达,在肝脏内表达量最高,脾脏内表达量最低。利用CRISPR/Cas9构建了scd基因敲除的斑马鱼(Daniorerio)模型进行功能验证,与野生型[SCD(+/+)]斑马鱼相比,纯合型[SCD~((–/–))]斑马鱼腹部明显膨大。Western blot和qRT-PCR结果显示,与SCD(+/+)组斑马鱼相比, scd基因在SCD~((–/–))组斑马鱼中表达显著降低(P

桐油是制备生物柴油的优势原料。delta 8脱饱和酶基因与植物膜脂、鞘磷脂的生物合成及细胞信号传递途径有关。通过简并PCR扩增、3’RACE、5’RACE及编码区扩增获得了油桐delta 8脱饱和酶的全长c DNA序列。该基因全长1 787 bp,ORF的长度为1 344 bp,编码447个氨基酸。经过网上比对分析,发现油桐delta 8脱饱和酶与其它植物的此基因具有较高同源性,其中与蓖麻脂肪酸去饱和酶相似度达83%。研究结果为揭示油桐油脂合成途径及分子定向育种奠定基础。

桐油是制备生物柴油的优势原料。ｄｅｌｔａ ８脱饱和酶基因与植物膜脂、鞘磷脂的生物合成及细胞信号传递途径有关。通过简并ＰＣＲ扩增、３’ＲａＣｅ、５’ＲａＣｅ及编码区扩增获得了油桐ｄｅｌｔａ ８脱饱和酶的全长Ｃ ｄＮａ序列。该基因全长１ ７８７ ｂＰ，ＯＲＦ的长度为１ ３４４ ｂＰ，编码４４７个氨基酸。经过网上比对分析，发现油桐ｄｅｌｔａ ８脱饱和酶与其它植物的此基因具有较高同源性，其中与蓖麻脂肪酸去饱和酶相似度达８３％。研究结果为揭示油桐油脂合成途径及分子定向育种奠定基础。

【目的】油茶种仁含油率较低且易遭逆性环境等的影响,这些都严重影响和制约了油茶产业的快速发展。丙二酰单酰Co A:ACP转酰酶是脂肪酸合成酶(FASⅡ)复合体的组成酶之一,在脂肪酸合成中起着装载作用,它的酶促反应产物丙二酰单酰ACP是脂肪酸合成关键组成部分。开展该基因的功能研究,能为油茶的分子遗传育种奠定基础。【方法】以油茶品种‘华硕’种子为材料,借助其种子转录组和表达谱数据库,通过RACE技术,克隆丙二酰单酰Co A:ACP转酰酶基因并对该基因进行生物信息学分析。利用常规的酶切连接技术构建基因的原核表达载体,并利用α酮戊二酸脱氢酶(KDH)偶联系统测定表达产物的酶活性。【结果】丙二酰单酰Co ...

为探究脂酰辅酶A脱氢酶对脂肪酸β氧化的调控机制,使用RT-PCR在鲤鱼肝脏克隆了脂酰辅酶A脱氢酶家族中的MCAD和LCAD全长c DNA序列,阅读框分别为1 275,1 326 bp,编码424,441个氨基酸,分析表明他们均具备ACADs家族的特征序列:FAD结合位点、底物结合位点、催化位点等,与斑马鱼MCAD和LCAD的一致性分别为93.16%和94.56%。实时定量RT-PCR结果表明,MCAD和LCAD主要在肝脏和心脏表达;不同脂肪源对MCAD的表达没有明显影响,但鱼油对LCAD的表达有明显的刺激

利用RNAi原理构建花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因的hpRNA表达载体,以抑制该基因的表达,获得高油酸/亚油酸比值的花生种质。根据花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因序列(GenBank:AF248739)设计引物,以豫花4号花生品种DNA为模板,克隆了该基因的启动子及长度约500 bp的外显子片段,在此基础上构建完成由自身启动子引导的花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因的反向重复片段RNAi载体pCAMBIA1301-Afad12Ri。

为了研究海水鱼合成高度不饱和脂肪酸(Highly unsaturated fatty acids,HUFAs)的关键酶,本研究克隆了军曹鱼(Rachycentron canadum)的△6脂肪酸去饱和酶的部分cDNA序列。根据GenBank已公布的其他鱼类的△6脂肪酸去饱和酶cDNA序列进行分析,设计了一对用于PCR扩增军曹鱼的△6脂肪酸去饱和酶基因保守序列的引物;然后以军曹鱼肝总RNA为模板,通过RT-PCR的方法扩增出一段长度为743bp的片段,该片段经纯化后,连接至pMD18-T载体上进行测序。结果显示,该片段与欧洲狼鲈(Dicentrarchus labrax)△6脂肪酸去饱和酶基因的...

根据中华绒螯蟹FAD9基因cDNA序列(Accession Number:JQ693685)设计引物,扩增得到中华绒螯蟹FAD9基因的开放阅读框(ORF),用原核表达载体p Cold-TF DNA成功构建重组表达载体p Cold-fad9,将p Cold-fad9转入大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S,在异丙-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下进行表达。SDS-PAGE分析表明,诱导后出现的特异性蛋白条带,大小与预期理论值(95.10 k D)相符。当IPTG浓度为0.3 mmol/L时,在15℃条件下诱导20 h,重组蛋白的表达量最高。目的蛋白主要存在于上清溶液中,为可溶性表达。利用...

［目的］通过表达载体ｐ ＥＴ－２８ａ（＋）在大肠杆菌中克隆表达蜜蜂螺原体ＳｐｉｒｏｐｌａＳｍａ ｍＥｌｌｉｆＥｒｕｍ ＣＨ－１中可能与致病相关的几丁质脱乙酰酶（ＣＨｉＴｉｎ ｄＥａＣＥＴｙｌａＳＥ，Ｃｄａ）基因ＣＨｉｄ，并测定其部分酶学性质，为进一步研究该基因在蜜蜂螺原体致病过程中的作用奠定基础。［方法］利用ｏｖＥｒｌａｐ ＥｘＴＥｎＳｉｏｎ ｐＣｒ（ｏＥ－ｐＣｒ）定点突变技术，在引物设计时插入目的突变，通过３次ｐＣｒ获得突变后的目的片段，测序验证后构建重组质粒ｐ ＥＴＣＨｉｄ，挑取ＢｌＣＨｉｄ表达菌株。ｉｐＴＧ诱导表达目的蛋白，ｎＴａ－ｎｉ２＋柱纯化，ＷＥＳＴＥｒｎ ＢｌｏＴＴｉｎＧ验证，紫．．．

根据NCBI中大豆fad2-1序列设计引物,用PCR方法从大豆的基因组DNA中扩增大豆脂肪酸脱饱和酶基因,克隆到pMD18-Tvector中,转化大肠杆菌JM109菌株,进行测序与比对。然后,将其反向克隆到表达载体pBt,转化农杆菌菌株LBA4404,经双酶切鉴定和PCR扩增检测,获得具有该基因的农杆菌工程菌。结果表明,克隆的fad2-1基因为1 196 bp,基因序列与NCBI中已发表的fad2-1序列只有4%的差异,相似性大于95%,说明克隆的基因是大豆fad2-1基因;构建了该基因的反向表达载体,转入农杆菌内。这为利用农杆菌介导法把该反义基因转入大豆,改良脂肪酸成分奠定了基础。

【目的】克隆获得棉铃虫(Helicoverpa armigera)磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine binding protein,PEBP)的c DNA序列,分析Ha PEBP在棉铃虫体内的表达规律,检测2-十三烷酮处理条件下棉铃虫体内Ha PEBP的变化情况,为进一步明确棉铃虫PEBP的功能和选择该基因作为调控棉铃虫种群数量的分子靶标提供依据。【方法】利用RACE技术从棉铃虫6龄幼虫的中肠组织中扩增得到Ha PEBP的c DNA序列,并对其氨基酸序列和蛋白结构进行分析。将Ha PEBP的ORF序列连接至p ET32a载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后检测目的蛋白的表达形式,并通过镍柱的亲和层析纯化融合蛋白。最后通过实时荧光定量PCR检测棉铃虫幼虫不同时期和6龄幼虫不同组织中Ha PEBP的表达规律,以及2-十三烷酮处理棉铃虫6龄幼虫后中肠内Ha PEBP的变化规律。【结果】获得的Ha PEBP c DNA序列长760 bp,其中ORF为588 bp,编码195个氨基酸,蛋白质分子量和等电点分别为21.76 k D和5.93。氨基酸序列分析表明Ha PEBP无信号肽、跨膜结构域和二硫键,是一个由4个α螺旋和9个β折叠片组成的胞质单体蛋白。将BL21(DE3)-p ET32a-Ha PEBP重组菌用1 mmol·L-1的IPTG在37℃条件下诱导4 h,约40 k D的融合蛋白His-Ha PEBP能以可溶的形式存在于重组菌中。按照同样的方法诱导1 L的重组菌,将超声处理后的上清液与Ni-NTA柱结合,进行咪唑缓冲液梯度洗涤,200 mmol·L-1的咪唑洗涤两次后得到约40 k D的单一蛋白,与融合蛋白的大小一致。将此流出液超滤浓缩,获得183.3 ng·μL-1的融合蛋白,能被抗His-Tag的单克隆抗体识别发生免疫反应。Ha PEBP在棉铃虫幼虫的1—6龄期和预蛹期均表达,且6龄幼虫的表达量最高。该基因在6龄幼虫的脂肪体、中肠、头部和体壁中也均有表达,且脂肪体内的表达量最高。不同浓度的2-十三烷酮处理后,棉铃虫6龄幼虫中肠内Ha PEBP的表达量均有所降低;低浓度(2.5和5 mg·g-1)在6 h就能降低Ha PEBP的表达量,其m RNA含量随着时间的延长逐渐增加;而高浓度(10和15 mg·g-1)在12 h才会降低Ha PEBP的表达量,其m RNA含量随着时间的延长先下降后上升。【结论】克隆分析了Ha PEBP,利用大肠杆菌系统表达出可溶的融合蛋白His-Ha PEBP,并通过镍柱-咪唑纯化法得到了高纯度的融合蛋白,时空表达分析显示Ha PEBP在棉铃虫6龄幼虫和脂肪体中表达量最高,2-十三烷酮处理6龄幼虫后中肠内Ha PEBP的表达量显著降低。

以葡萄桐近成熟种子为材料,根据油桐转录组数据库中已知部分烯脂酰CoA还原酶(enoyl-CoA reductase,ECR)序列,利用RACE克隆技术,克隆得油桐烯脂酰CoA还原酶的全长c DNA序列,命名为VfECR,并对该基因的核苷酸序列及其相应氨基酸序列的理化性质、疏水性/亲水性、跨膜结构域、蛋白质的二、三级结构、亲缘关系进行分析。结果表明:该基因全长1 154 bp,含有一个933 bp的开放阅读框,编码310个氨基酸,属于不稳定的亲水性蛋白,含有6个明显的跨膜结构域,且与陆地棉ECR蛋白的同源性最高,亲缘关系最为接近。同时利用RT-qPCR对VfECR基因的组织特异性和种子发育过程中...