【目的】研究中草药单味及复方提取物对原代培养的小鼠乳腺上皮细胞增殖的影响,旨在为探明中草药治疗奶牛乳腺疾病机制提供试验依据。【方法】采用组织块种植法培养3月龄、分娩后3~5 d的昆明种远交系小白鼠的乳腺组织,采用胰蛋白酶消化法获得相对纯化的小鼠乳腺上皮细胞,并运用SDS-PAGE法进行鉴定。制备5味中草药(重楼、紫花地丁、木芙蓉、半枝莲、泽兰叶)及治疗奶牛乳房炎用中草药复方提取物,分别作用于对数生长期的乳腺上皮细胞5 d,用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)分析细胞活力。【结果】将通过组织块种植法与胰蛋白酶消化法相结合,可得到纯化的有酪蛋白分泌功能的乳腺上皮细胞;中草药重楼、紫花地丁、木芙蓉、半枝莲...

【目的】研究中药复方灌注液及其中的单味中药提取物对原代培养的奶牛乳腺上皮细胞增殖及总蛋白含量的影响。【方法】采用原代组织块贴壁法获得奶牛乳腺上皮细胞,以质量浓度为5,10,15和20mg/mL的中药复方灌注液以及紫花地丁、黄芪、泽兰、鸡血藤、诃子提取物,分别作用于对数生长期的奶牛乳腺上皮细胞,确定最适宜中药质量浓度,采用该质量浓度提取物处理对数生长期的乳腺上皮细胞,并分别在处理的1,3和5d时取样,采用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测细胞活性,并测定细胞分泌的总蛋白含量。【结果】通过组织块贴壁与胰蛋白酶消化法相结合,得到较纯化的奶牛乳腺上皮细胞。泽兰、鸡血藤、复方灌注液在质量浓度为10mg/m...

【目的】以王不留行为试验材料,寻找王不留行促进泌乳的有效成分,为中药催乳针剂的研发提供理论依据。【方法】对王不留行3类主要成分(皂甙类、黄酮甙类及香豆素类)进行提取,并用化学方法及薄层层析方法予以鉴定。将3种成分分别以不同浓度添加到细胞培养液,采用MTT法检测3类成分对体外培养的小鼠乳腺上皮细胞增殖的作用,运用荧光定量RT-PCR方法对细胞中β-酪蛋白的表达进行检测,用激光共聚焦显微技术对细胞周期蛋白cyclinD1和细胞信号通路中磷酸化stat5因子的表达进行检测,最后通过动物实验进一步验证其有效成分的作用。【结果】王不留行皂甙类成分对小鼠乳腺上皮细胞的增殖有明显的抑制作用(P<0.05),...

【目的】MicroRNA(miRNA)是一类长度约21-23个核苷酸的非编码小RNA分子,本研究旨在分析高温条件下miRNA-24对乳腺上皮细胞生长、凋亡的作用及其初步机制。【方法】体外培养奶牛乳腺上皮细胞,高温(41℃)处理所培养的细胞;应用miRNA基因沉默技术,抑制高温处理过的乳腺上皮细胞中miRNA-24的表达;采用细胞计数法分析细胞增殖情况;Hoechst33342/PI荧光染色、流式细胞术检测miRNA-24对乳腺上皮细胞凋亡的作用,Western blot检测凋亡相关因子表达变化。【结果】抑制miRNA-24的表达,高温条件下的乳腺上皮细胞增殖能力显著增强(P<0.05),凋亡细...

【目的】探究苦参碱对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）增殖、凋亡及抗氧化能力的影响。【方法】利用含0（A组），25（B组），50（C组），75（D组）和100 μg/mL（E组）苦参碱的培养基培养奶牛乳腺上皮细胞。通过四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测BMECs活性，采用流式细胞仪（AnnexinV/PI双染法）检测苦参碱对BMECs凋亡的影响，并检测苦参碱对BMECs抗氧化酶活性及丙二醛（MDA）含量的影响，采用real-time PCR对BMECs中Caspase-3、p53、STAT1和SOCS3

[目的]本文旨在研究芪薏术蝎方不同提取物对癌变细胞的修复作用。[方法]以芪薏术蝎方水提物、多糖提取物和醇提物3种药物为试验药物,以紫杉醇为阳性对照药物,以三氯卡班(triclocarban,TCC)单独长期处理细胞为阳性对照,以正常乳腺上皮细胞(EpH4-Ev)为阴性对照,以各药物的最大安全浓度为有效工作浓度,将药物和TCC同时加入到EpH4-Ev单层细胞中,以暴露48 h为1个循环周期,连续重复6个周期(T-6)后测定细胞增殖率、细胞内ROS水平、细胞内ERK通路的活化程度、DNA双链断裂程度、细胞的总凋亡率以及非停泊性生长和细胞迁移率等癌症相关的指标,评估药物对TCC长期暴露处理所致细胞癌变的影响。[结果]与阳性对照细胞相比,4种药物均能够显著抑制长期暴露于TCC的细胞发生非停泊性生长和细胞迁移;细胞内ROS水平显著升高,DNA双链断裂程度以及细胞的总凋亡率均显著升高;各药物组细胞增殖率显著下降,细胞内ERK通路的活化程度受到显著抑制。各提取物多数指标优于紫杉醇。[结论]芪薏术蝎方提取物与紫杉醇均能通过促进癌变细胞产生大量的ROS,从而引起细胞增殖抑制,ERK通路抑制,促进癌变细胞DNA损伤和细胞凋亡,最终修复由TCC诱导形成的癌变细胞。

【背景】MicroRNAs(miRNA)是一类小RNA分子（18—23nt），广泛参与了家畜乳腺发育和泌乳性能的调控。项目组前期在小尾寒羊上应用RNA-Seq研究发现，miR-221在空怀期乳腺组织中的表达量是泌乳期的3.6倍，但是尚不清楚miR-221对绵羊乳腺发育的调控机制。【目的】探讨miR-221是否通过靶向基因IRS1抑制绵羊乳腺上皮细胞的活力和增殖数量，为揭示miR-221对绵羊泌乳性能的分子调控机理提供理论参考。【方法】采集小尾寒羊乳腺、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、背最长肌和卵巢等8个组织样本，采用实时荧光定量PCR(reverse transcription-quantitative PCR,RT-qPCR)技术，构建miR-221在绵羊8个组织中的表达谱。采用细胞转染、CCK-8和Edu等方法，研究miR-221对绵羊乳腺上皮细胞活力和增殖的影响。利用miRDB和miRanda数据库，预测miR-221的靶基因，结合功能富集分析，确定目标靶基因，构建靶基因的野生型和突变型载体，进而用双荧光素酶报告实验，验证miR-221与预测靶基因间的靶向关系。分析过表达和沉默miR-221对靶基因及其信号通路下游功能基因的影响。【结果】RT-qPCR结果表明，miR-221在绵羊乳腺等8个组织中均表达，其中在肺脏和脾脏中的表达量最高，在背最长肌和肾脏中的表达量最低。CCK-8结果表明，miR-221模拟物抑制了绵羊乳腺上皮细胞的活力（P<0.01），而miR-221抑制剂提高了乳腺上皮细胞的活力（P<0.05）。Edu试验发现，miR-221模拟物减少了Edu标记的阳性乳腺上皮细胞数量（P<0.01），而miR-221抑制剂增加了Edu标记的阳性乳腺上皮细胞数量（P<0.01），而miR-221抑制剂提高了该基因的活性（P<0.05），表明IRS1是miR-221的一个靶基因。RT-qPCR结果进一步发现，过表达miR-221降低了绵羊乳腺上皮细胞中IRS1和PIK3R1的表达量（P<0.05），沉默miR-221则提高了这2个基因的表达量（P0.05）。【结论】miR-221通过抑制靶基因IRS1的表达量，最终抑制了绵羊乳腺上皮细胞的活力和增殖数量。

【目的】探讨TGF-β1对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡和HSP70蛋白表达的影响。【方法】TGF-β1作用乳腺上皮细胞不同时间,收集细胞及培养液,应用MTT检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞凋亡率、比色法检测LDH活性、琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性、Western bolt技术分析HSP70蛋白的表达量。【结果】1、5、10ng·ml-1的TGF-β1均能抑制乳腺上皮细胞的增殖,且随浓度增加抑制作用加大,呈现剂量依赖性,其中10ng·ml-1TGF-β1组与对照组差异显著(P<0.05);10ng·ml-1TGF-β1作用于乳腺上皮细胞,随着作用时间的延长,细胞凋亡率逐渐升高,其中6、12和24...

[目的]广谱抗菌剂三氯卡班(TCC)在各种环境介质和生物体中被频繁检出。为了研究TCC对动物的危害,观察了TCC对正常小鼠乳腺上皮细胞(Ep H4-Ev)的急慢性损伤作用,评价其对乳腺上皮细胞的诱癌作用,为防止TCC在动物用品中的滥用提供理论依据。[方法]采用MTT法确定TCC的最佳工作浓度后,作用于Ep H4-Ev细胞,以48 h为1个药物作用循环,分别作用3和6个循环(命名为T3和T6细胞)后,使用MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞内活性氧簇(ROS)水平,Western blot法测定细胞内磷

[目的]本试验旨在探究TNF-α（肿瘤坏死因子-α）诱导对小鼠乳腺上皮细胞凋亡和程序性坏死的影响。[方法]体外培养小鼠乳腺上皮细胞系（HC-11细胞）并分为四个处理组，对照组（Ctrl），TNF-α组（T），TNF-α+CHX（环己酰亚胺）组（TC），TNF-α+CHX+Z-VAD-FMK（广谱caspase家族抑制剂）组（TCZ）；细胞加药浓度为TNF-α:（20、50、100 ng·mL~(-1)）、CHX: 4 μmol·L~(-1)、Z-VAD-FMK: 20 mmol·L~(-1)。[结果]与对照组相比，100 ng·mL~(-1) TNF-α（T-100）处理12 h后细胞活力显著降低（P<0.01），而TCZ组caspase-8的mRNA水平显著降低（P<0.001），但只有TCZ组程序性坏死标志蛋白RIP3、MLKL和p-MLKL的表达量显著上升（P<0.001），TCZ组的PGAM5蛋白表达水平显著上升（P<0.01），TC组和TCZ组的Drp1的mRNA和蛋白表达水平均显著上升（P

【目的】为了研究微小RNA let-7a（microRNA let-7a，miR-let-7a）对脂磷壁酸（Lipoteichoic acid，LTA）诱导的炎性奶牛乳腺上皮细胞（MAC-T）的增殖和凋亡的作用。【方法】通过实时荧光定量PCR（Quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）、实时细胞分析仪和流式细胞术检测过表达和抑制表达miR-let-7a在炎性MAC-T中的影响。【结果】qRT-PCR检测结果显示，转染miR-let-7a 模拟物会使炎性MAC-T细胞中miR-let-7a的表达量极显著上调（P<0.001），转染miR-let-7a 抑制剂会使细胞中miR-let-7a的表达量极显著下降（P<0.001）；RTCA结果显示，转染miR-let-7a 模拟物能明显促进MAC-T细胞增殖，转染miR-let-7a 抑制物会使MAC-T细胞的增殖受到抑制；流式细胞术结果显示，转染miR-let-7a 模拟物的MAC-T细胞的凋亡率显著降低（P<0.01）；而转染miR-let-7a 抑制剂则与之相反，MAC-T细胞的凋亡率显著升高（P<0.01）。即过表达miR-let-7a可以促进MAC-T细胞增殖，并降低细胞的凋亡率。而抑制表达miR-let-7a的作用与之相反，抑制表达miR-let-7a使MAC-T细胞的增殖下降，细胞的凋亡率增大。【结论】miR-let-7a是一种抑制炎症调节因子，其过表达可以缓解牛乳腺炎，为阐明奶牛乳腺炎的分子调控机制奠定了基础。

[目的]阐明雷帕霉素(Rapa)对大肠杆菌诱发的乳腺感染的保护作用机制,为临床上寻找乳腺炎防控新方法提供理论依据。[方法]原代培养大鼠乳腺上皮细胞,待细胞贴壁后,试验组采用100 nmol·L~(-1)的Rapa处理4 h后,细胞经感染比(MOI)为10的大肠杆菌处理2 h后用细胞刮刀刮取细胞,收集细胞上清液,用于Toll样受体4(TLR-4)及髓样分化因子(MyD88)蛋白、促炎性细胞因子表达及活性氧(ROS)释放检测。[结果]大肠杆菌刺激原代培养的乳腺上皮细胞后,TLR-4和MyD88蛋白表达显著升高;而Rapa预处理可降低MyD88蛋白表达;同时,大肠杆菌刺激后,乳腺上皮细胞中促炎性细胞因子,如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)的表达及ROS的释放均显著升高。雷帕霉素能下调促炎性细胞因子的释放,显著降低ROS的释放量。[结论]Rapa抑制MyD88信号通路后可减轻大肠杆菌诱导的大鼠乳腺炎症反应。

为建立一种快速分离犬原代乳腺上皮细胞的培养方案，本研究旨在从健康泌乳金毛犬的乳汁中分离原代乳腺上皮细胞，接种于两种不同的培养基后传代培养，探讨不同培养基下细胞的生物学特征，提供犬乳腺上皮细胞简单便捷的分离措施及适宜的培养方法。选取泌乳一周的金毛犬在无菌条件下收集乳汁，离心处理后得到乳腺上皮细胞，分别用完全培养基和基础培养基接种培养，经形态学对比观察，间接免疫荧光检测角蛋白8(Cytokeratin 8)表达情况，绘制两种培养基培养下的第3代乳腺上皮细胞生长曲线；探讨完全培养基培养的第6代乳腺上皮细胞的冻存复苏活力。结果表明：1)乳汁分离可得到大量细胞团块，分别接种两种培养基后都会出现“煎蛋样”贴壁细胞，消化传代后两者均有Cytokeratin 8的高度表达；2)接种于基础培养基的细胞前期以聚集在一起的圆形单克隆细胞团块为主，传至第4代仅有少量细胞存活，细胞随着培养时间增加而状态变差，死亡细胞增多；接种于完全培养基的细胞整体呈“鹅卵石铺路样”成片生长，随着传代次数增加细胞状态稳定，细胞生长曲线呈现“S”形；3)完全培养基培养的第6代乳腺上皮细胞冻存复苏后能快速贴壁并分裂增殖。综上，乳汁分离法成功分离犬乳腺上皮细胞，且与基础培养基相比，完全培养基可以更好地维持细胞活性，促进细胞增殖分裂，且不影响细胞冻存后复苏的活力，为后期快速分离犬乳腺上皮细胞提供较优的培养方案。

ＮＩＨ小鼠孕期连续服用牛初乳提取物（ＢＣＥ）、活性钙和蒸馏水，孕后第１８天解剖母鼠，检查胎鼠骨骼发育情况。结果表明，ＢＣＥ能显著促进胎鼠骨骼的生长发育，比单纯补钙更有效。用离体培养的新生大鼠头盖骨成骨细胞检测不同浓度的ＢＣＥ和表皮生长因子（ＥＧＦ）的促细胞增殖作用时发现，ＢＣＥ浓度在２μｇ／ｍＬ至２０ｍｇ／ｍＬ之间递增时，其促细胞增殖作用随之加强，继续提高浓度则对细胞增殖产生抑制作用；不同浓度的ＥＧＦ也有促细胞增殖作用，但ＥＧＦ的剂量曲线比较平缓，提示ＢＣＥ的促细胞增殖作用是多种生长因子协同作用的结果。实验结果表明ＢＣＥ具有促进骨骼发育的作用。

　通过有效的细胞培养方法获得了牛乳腺上皮细胞系,并系统观察了乳腺上皮细胞的长出、贴壁、聚集、迁移、分裂、分化、凋亡等一系列形态变化。结果发现,原代培养的乳腺上皮细胞大多数呈卵圆形,细胞之间连接成片,单层生长,如鹅卵石铺过路面,乳腺上皮细胞和成纤维细胞混生时分区生长,界线明显。传代的乳腺上皮细胞呈岛屿状聚集生长,细胞核呈圆形或椭圆形,核仁2～4枚;在含雌激素的培养液中,细胞出现双核或多核现象,但仍表现一定的接触抑制现象。多次传代后的乳腺上皮细胞含不同的细胞类型,通过光镜观察,部分细胞仍保持较快的分裂增殖能力;部分细胞渐渐分化,出现长形细胞、三角形细胞。上皮细胞增殖分化可形成圆顶型结构,乳腺上皮细...