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[期刊] 中国水产科学
[作者]
卜兴江 仉晓文 孙允东 赵小凡 王金星
组织蛋白酶L属于半胱氨酸蛋白酶中的木瓜蛋白酶超家族,在哺乳动物中它与抗原提呈、肿瘤入侵和转移、骨质吸收、细胞凋亡等许多生命活动有关。但对其在无脊椎动物中的功能了解的不多。从中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)中克隆得到了组织蛋白酶L基因,为了进一步研究组织蛋白酶L的组织分布及其功能,对该基因进行了重组表达。将中国明对虾组织蛋白酶L基因的酶原片段亚克隆进原核表达载体pET30a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),再进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳检测,其分子量在40kD左右,与期望的中国明对虾组织蛋白酶L的分子量一致。表达产物形成包涵体,经过对包涵体变性和复...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
潘光照 张奎 李重阳 赵羽卒 申利 徐曼 苏晶晶 林西 崔红娟
【目的】鉴定克隆家蚕组织蛋白酶L基因BmCathepsin L(BmCat L),分析其序列和表达特征。分析家蚕组织蛋白酶L在大肠杆菌诱导下m RNA表达量的变化趋势,为进一步研究家蚕组织蛋白酶L的功能打下基础。【方法】基于家蚕基因组数据库(Silk DB)中序列BGIBMGA006893设计引物,利用RACE技术克隆家蚕组织蛋白酶L基因的cDNA全长序列,通过在线工具对基因结构和蛋白质分子量及等电点进行预测;在NCBI数据库下载其他物种组织蛋白酶L同源序列,利用Clustalx(1.83)和MEGA 6
[期刊] 中国水产科学
[作者]
李树红 陈志光 李冉 李新 李松 陈秀华 蒋然然 李美良 马璐阳
对原核表达的重组建鲤组织蛋白酶L(Cathepsin L,CAT L)蛋白进行尿素洗涤和Ni-NTA亲和层析纯化,该目的蛋白经300 mmol/L咪唑洗脱为单一峰,SDS-PAGE结合TSK-GEL G2000SWxl凝胶过滤高效液相色谱分析表明重组CAT L获得了高度纯化,分子量约28 k D,纯度超过95%。Z-Phe-Arg-MCA底物测活法显示该重组CAT L表现为半胱氨酸蛋白酶活性,能与其内源抑制因子Cystatin以1︰1的摩尔比结合,具有生物学活性。以纯化的重组CAT L蛋白免疫Balb/C小鼠获得抗血清,经ELISA法检测获得的CAT L抗血清效价高于1︰512000;West...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
麻建军 张殿昌 崔淑歌 姜晶晶 蒲含林 江世贵
为了研究合浦珠母贝(Pincatada fucata)的先天免疫调控机制,利用cDNA文库筛选和重测序技术克隆了1个合浦珠母贝组织蛋白酶L的全长cDNA序列(命名为poCL2)。poCL2cDNA全长1094bp,5′-非编码区(Untranslated region,UTR)长21bp,3′-UTR长80bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)为993bp,编码330个氨基酸组成的多肽链,分子量为37.1kD,理论等电点为6.9。poCL2蛋白由信号肽(Met1-Ala16)、前体域(Arg17-Asp113)和成熟域(Leu114-Val330)三部分组成,存在一个...
关键词：
合浦珠母贝 组织蛋白酶L 先天免疫
[期刊] 水产学报
[作者]
王丹丹 刘逸尘 张亦陈 孙妍 耿绪云 孙金生
Serpin家族成员作为主要的丝氨酸蛋白酶抑制剂,通过调节一系列丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶的活性来调节蛋白酶级联反应,进而参与了包括血液凝结、补体激活、纤维蛋白溶解、炎症反应、肿瘤抑制和激素转运等大量的基本生物过程,在调节机体免疫及其它重要生理功能等方面发挥着重要作用。在前期研究中,从中国明对虾血细胞中克隆得到一个serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(Fc-serpin,GenBank登录号:DQ318857),初步研究显示它在转录水平参与了病原菌和白斑杆状病毒(WSSV)引发的中国明对虾先天免疫应答反应;利用原核重组表达系统,成功获得了重组的中国明对虾serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂(rF...
[期刊] 水产学报
[作者]
彭扣 胡蓓娟 赵大显 王军花 盛军庆 吴娣 史建伍 洪一江
为了解淡水贝类是否存在组织蛋白酶Ｌ的亚型及其亚型的免疫相关作用，本实验利用已构建的池蝶蚌血细胞全长ｃ ＤＮＡ文库，筛选获得与之同源的ＥＳＴ序列，结合ＲＡｃＥ技术进一步克隆了池蝶蚌一个新的组织蛋白酶Ｌ基因的ｃ ＤＮＡ全长，命名为ＨＳ ｃＴＳ Ｌ１－ＬｉｋＥ基因（ＧＥＮ ＢＡＮｋ登录号为ｋＦ０１５２７３）。该序列全长为１２８０ Ｂｐ，５′－非翻译区（５′ＵＴＲ）为３１ Ｂｐ，３′－非翻译区（３′ＵＴＲ）为２５６ Ｂｐ，开放阅读框区（ＯＲＦ）为９９３ Ｂｐ，编码３３０个氨基酸，预测蛋白相对分子量为３６．８６ ｋＵ，理论等电点为６．２３。序列分析结果显示，ＨＳ ｃＴＳ Ｌ１－ＬｉｋＥ与其他软体动物相对．．．
[期刊] 中国水产科学
[作者]
解家松 许婷 刘玮 何中央 吴信忠
采用RT-PCR方法扩增、克隆和鉴定了泥蚶(Tegillarca granosa)的金属硫蛋白(Metallothionein,MT)基因(TgMT)的开放阅读框(ORF)。基于金属硫蛋白氨基酸序列构建的系统进化树表明,泥蚶和魁蚶(Scapharca broughtonii)的亲缘关系最近。利用ORF序列,构建原核重组表达质粒。重组质粒经PCR、酶切鉴定及测序验证后转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导,表达重组蛋白,重组蛋白的分子量约为28.3 kD。可溶性分析表明重组蛋白主要以可溶性形式存在。用His-tag柱亲和纯化重组蛋白,并利用重组蛋白制备...
关键词：
泥蚶 金属硫蛋白 原核表达 组织细胞分布
[期刊] 水产学报
[作者]
吴东蕾 左迪 黄有辉 马长安 赵云龙
为深入了解红螯光壳螯虾组织蛋白酶L基因的表达特性及维生素C对其表达的影响,实验利用RACE-PCR技术及荧光定量PCR技术,从红螯光壳螯虾肝胰腺中克隆得到组织蛋白酶L基因cDNA全长序列,命名为CqCatL(GenBank登录号:KJ913663),同时检测了该基因在红螯光壳螯虾各个组织及添加了不同浓度维生素C的组别中的表达。结果显示,该基因全长1 810 bp,开放阅读框长度为1 026 bp,编码341个氨基酸残基,预测的分子量和等电点(pI)分别为37.63 ku和5.17。同源性分析结果显示,该基因编码的蛋白与其他虾蟹类有较高的相似性,说明组织蛋白酶L基因在甲壳动物具有较高的保守性。组...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
袁新程 施永海 徐嘉波 于爱清 邓平平 张之文 蒋飞
为探明美洲鲥(Alosa sapidissima)雌鱼发育后期卵巢内营养物质的变化规律，提高卵子受精率，采用生化分析、酶联免疫吸附及荧光定量PCR等方法，对性腺发育期Ⅳ期和Ⅴ期的卵巢内氨基酸、脂肪酸、卵黄蛋白原（VTG）和组织蛋白酶D（CTSD）含量及其mRNA表达量进行对比分析。结果显示，Ⅳ期卵巢中水分含量(75.73%)显著低于Ⅴ期(90.64%)(P<0.05)，而粗蛋白含量(16.07%)、粗脂肪含量(2.86%)和粗灰分含量(1.28%)均显著高于Ⅴ期 (5.83%、1.25%、0.81%)(P<0.05)。在Ⅳ、Ⅴ期卵巢内各检测出18种氨基酸，其中谷氨酸含量最高(8.64%和8.13%)；8种必需氨基酸中，Ⅳ期苏氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和色氨酸含量均显著高于Ⅴ期 (P＜0.05)，且二者第一限制氨基酸均为色氨酸；Ⅳ期氨基酸总量(TAA)、半必需氨基酸(HEAA)和非必需氨基酸总量(NEAA)均显著高于Ⅴ期(P＜0.05)。两期卵巢内共检测出19种脂肪酸，Ⅳ期C17:0、C20:1n9、C20:4n6和C20:5n3含量显著高于Ⅴ期(P＜0.05)；其中∑MUFA、∑PUFA、∑UFA、∑n3PUFA和EPA+DHA含量均大于Ⅴ期，∑UFA (70.54%)达到显著性差异(P＜0.05)。Ⅳ期卵巢中VTG含量高于Ⅴ期，但不显著(P＞0.05)；而Ⅳ期卵巢中CTSD含量明显比Ⅴ期低 (P＜0.05)。Ⅴ期卵巢VTG 基因表达量是Ⅳ期的13.88倍(P＜0.05) ；而Ⅴ期肝脏内VTG 基因表达明显低于Ⅳ期(P＜0.05)，是Ⅳ期的25%。从Ⅳ期至Ⅴ期，卵巢中CTSD mRNA表达出现下调，肝脏中CTSD mRNA表达出现上调，但均不明显。因此，当前养殖条件下，美洲鲥雌鱼亲本后期发育过程中，卵巢内营养物质积累不均衡，建议适当调整饲料配方，提高限制性氨基酸色氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸及含量较低的赖氨酸、苏氨酸比例和调高多不饱和脂肪酸C20:3n6、C20:4n6(AA)、C22:6n3(DHA)和C20:5n3(EPA)比例，降低C18:2n6c的比例，保证卵巢后期发育所需营养的均衡。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
苏晶晶 陈思源 张奎 余霜 李钰添 梁航华 赵羽卒 晁会娟 崔红娟
【目的】克隆家蚕(Bombyx mori)蛋白酶O基因Cathepsin O(Bm Cat O),分析其m RNA表达特征,通过原核表达、蛋白纯化和多次免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,为进一步探究组织蛋白酶O在家蚕变态发育中的功能奠定基础。【方法】利用RACE技术克隆获得家蚕组织蛋白酶O的全长c DNA序列,然后采用RT-PCR对其时空表达特征进行研究。从NCBI下载其他物种组织蛋白酶O基因序列,利用Clustalx和MEGA 6.0软件进行同源比对和进化分析。选取特异性较高的片段设计特异性引物,将PCR扩增产物连接至PET32a质粒,转化至E.coil表达菌株Rosetta(DE3),经IP...
[期刊] 水产学报
[作者]
黄明 刘逸尘 张亦陈 孙妍 孙金生
Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂可以通过精确调控丝氨酸蛋白酶的活力,在生物体的防御应答等众多生物过程中发挥重要作用。以前期克隆的中国明对虾Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(Fc-Kazal,GenBank注册号为DQ318856)为基础,对其功能结构域进行序列比对和进化分析;组织表达分析结果表明,该基因在血细胞、鳃和淋巴器官等组织中高水平表达,而在眼柄、神经和肌肉中无表达;利用原核表达系统对该基因成熟肽区域成功进行了重组表达,纯化后的目的蛋白最终得率为0.4 g/L培养液;活性分析结果显示,复性后的rFc-Kazal对鳗弧菌、金黄色葡萄球菌、杀鲑气单胞菌、苏云金芽孢杆菌有明显的抑菌作用。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李树红 张楠 刘欢 马长伟
鲢鱼鱼糜制品在加工过程中容易发生热诱导 (5 0～ 70℃ )的鱼糜凝胶软化 (modori) ,导致鱼糜制品品质下降。为探明原因 ,本研究比较了在加工过程中漂洗前后鲢鱼鱼肉糜中组织蛋白酶B ,L ,H活性的变化 ,结果表明漂洗后仍残留了组织蛋白酶B ,L ,H活性 ,其中组织蛋白酶L活性的残留率最高 ,为 2 5 6 1%± 0 82 %。用SDS PAGE分析了有无E 6 4存在下 ,鲢鱼背肌肌原纤维蛋白自溶过程中 (pH 6 5 ,5 0℃ ) ,肌球蛋白重链相对含量的差异 ,结果显示肌球蛋白重链相对含量的下降趋势与残留的组织蛋白酶活性变化趋势吻合 ;而且E 6 4部分抑制了肌球蛋...
关键词：
鲢鱼 组织蛋白酶 鱼糜凝胶软化 漂洗
[期刊] 水产学报
[作者]
胡亚芹 姚燕佳 陈建初
从南蓝鳕鱼糜中提取肌动球蛋白,对肌动球蛋白进行凝胶层析,测定各收集组分中L型组织蛋白酶的活性。结果表明,组织蛋白酶L依然存留于肌动球蛋白样品中,多次漂洗以及稀释-沉淀处理亦不能有效将其除去。凝胶层析图谱分析表明,该酶可能是肌动球蛋白非结合型酶。对凝胶层析所得粗酶液进行酶学性质分析,结果得知该酶最适温度为45℃,正好落在鱼糜凝胶劣化发生范围之内。专一性底物及酶激活剂、抑制剂影响研究表明,该酶为内含巯基的半胱氨酸型组织蛋白酶。该酶最适pH为5.5,在近中性pH范围内依然有较高的残留活性,表明该酶具有潜在凝胶劣化能力。
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵洁 梁爱华 付月君
为了研究Bm K IT提高Ac MNPV抗虫活性的作用机制,将Bm K IT基因插入到Ac MNPV中形成重组病毒。采用重组单价病毒Ac MNPV-Bm K IT(IE1)、Ac MNPV-Bm K IT(P10)、Ac MNPV-Bm K IT(PH)和一种重组双价病毒Ac MNPV-Bm K IT(P10)-vcath(PH),通过四唑盐比色法(MTT)和蛋白质印迹法(Western Blot)分析了Bm K IT在Ac MNPV的3个启动子调控下对Sf9细胞增殖和细胞凋亡的影响,结果显示,感染病毒36,48 h Bm K IT在不同启动子调控下表达量从高到低依次为PH、P10、IE1。同...
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵洁 梁爱华 付月君
为了研究Ｂｍ Ｋ ＩＴ提高Ａｃ ｍＮＰＶ抗虫活性的作用机制，将Ｂｍ Ｋ ＩＴ基因插入到Ａｃ ｍＮＰＶ中形成重组病毒。采用重组单价病毒Ａｃ ｍＮＰＶ－Ｂｍ Ｋ ＩＴ（ＩＥ１）、Ａｃ ｍＮＰＶ－Ｂｍ Ｋ ＩＴ（Ｐ１０）、Ａｃ ｍＮＰＶ－Ｂｍ Ｋ ＩＴ（ＰＨ）和一种重组双价病毒Ａｃ ｍＮＰＶ－Ｂｍ Ｋ ＩＴ（Ｐ１０）－ＶｃＡＴＨ（ＰＨ），通过四唑盐比色法（ｍＴＴ）和蛋白质印迹法（ＷＥｓＴＥｒＮ ＢｌｏＴ）分析了Ｂｍ Ｋ ＩＴ在Ａｃ ｍＮＰＶ的３个启动子调控下对ｓｆ９细胞增殖和细胞凋亡的影响，结果显示，感染病毒３６，４８ Ｈ Ｂｍ Ｋ ＩＴ在不同启动子调控下表达量从高到低依次为ＰＨ、Ｐ１０、ＩＥ１。同．．．
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