【背景】作为我国本土重要的资源昆虫，中华蜜蜂（Apis cerana cerana，简称中蜂）对我国初冬季低温开花植物的传粉具有重要的生态价值，其传粉习性与嗅觉系统密切相关。前期对中蜂采集蜂高、低温处理后的触角转录组数据分析发现，与昆虫嗅觉相关的尼曼匹克C2型蛋白（Niemann-Pick type C2 protein,NPC2）基因家族在低温时表达量上升。【目的】以中蜂NPC2家族基因为研究对象，克隆并分析其结构特征和表达谱以及高、低温处理下表达量的差异，为深入研究中蜂NPC2基因家族在中蜂低温适应的嗅觉感受功能提供参考。【方法】基于中蜂高、低温转录组测序结果，利用RT-PCR克隆获得中蜂NPC2基因ORF序列，进行系统进化树分析和三维结构预测，然后通过实时荧光定量PCR分析中蜂NPC2基因在不同发育时期、组织的时空表达谱，以及高、低温时的表达量变化。【结果】获得4个中蜂NPC2基因——AcNPC2a、AcNPC2b、AcNPC2c、AcNPC2d的ORF全长，分别为447、480、459和465 bp，编码148、159、152和154个氨基酸，预测蛋白分子量为16.12—18.53 kD，等电点分别为7.98、7.57、6.56和6.34。进化树分析显示AcNPC2与意大利蜜蜂的NPC2同源序列亲缘关系最近，与其他膜翅目昆虫NPC2也有一定相似性。实时荧光定量PCR结果显示，AcNPC2a在新出房蜂的腹部表达量最高，其次是在哺育蜂的腹部以及幼虫期；AcNPC2b在新出房蜂的胸部表达最高，在采集蜂的头部、胸部和后足也有表达；AcNPC2c在哺育蜂和采集蜂的触角中呈高丰度表达；AcNPC2d在采集蜂的头部表达量最高。经低温处理后，4个AcNPC2基因在采集蜂触角中的表达量均有所上升，但差异不显著。【结论】AcNPC2具有NPC2蛋白的保守结构，其基因家族成员在中蜂的时空表达谱中呈现多样性，其中AcNPC2c在触角中呈高丰度表达，表明其与中蜂嗅觉感受功能关系密切。AcNPC2基因家族在低温时采集蜂触角中表达量均有所上升，表明该基因家族有可能参与中蜂的低温适应性，或与初冬季访花行为有关。

【目的】完成中华蜜蜂(Apis cerana cerana)化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)基因家族的序列及表达谱鉴定,解析中蜂整个CSPs家族的表达特征与分布规律,为中蜂CSPs的生物学功能研究提供参考。【方法】利用RT-PCR技术扩增,克隆获得中蜂CSPs基因家族全部6条基因序列的开放阅读框(ORF)全长,并利用real-time PCR技术对中蜂所有的CSPs序列在中蜂工蜂不同发育历期及不同器官表达特征进行研究。【结果】新克隆4条基因(Ac-CSP2、Ac-CSP4、Ac-CSP5和Ac-CSP6)的开放阅读框分别为354、387、315和378 bp...

为探究中华蜜蜂磁响应基因的生物学功能，提取中华蜜蜂Apis cerana cerana(简称中蜂)总RNA,反转录制备cDNA,用特异性引物PCR扩增AcMagR和AcCry2基因的CDS序列，利用生物信息学软件对其功能结构域、系统进化树等进行分析；采用实时荧光定量PCR技术(qPCR)分析中蜂工蜂不同日龄(1、5、10、15、20、25、30日龄)和不同组织(头部、胸部和腹部)中AcMagR和AcCry2基因的相对表达量.结果表明，中蜂AcMagR和AcCry2基因的ORF序列长分别为393、1 713 bp,分别编码130、570个氨基酸.AcMagR蛋白存在1个Fe-S＿biosyn功能结构域，AcCry2蛋白则具有2个功能结构域(DNA＿photolyase和FAD＿binding＿7).系统发育树显示，中蜂AcMagR、AcCry2基因与西方蜜蜂关系最近，它们再进一步与小蜜蜂和大蜜蜂聚为一支.荧光定量PCR结果表明，AcMagR和AcCry2基因在不同日龄工蜂胸部的表达量显著高于头部和腹部，且在采集蜂胸部中表达量最高，该结果表明这两个基因在蜜蜂的采集飞行活动中发挥着重要作用.

为克隆意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）的AmMETTL3基因，解析AmMETTL3蛋白的分子特性，并测定AmMETTL3在工蜂不同组织及发育时期的表达谱。通过PCR扩增AmMETTL3的CDS并进行Sanger测序验证；使用相关生物信息学软件预测AmMETTL3的理化性质和分子特性，鉴定METTL3的结构域和保守基序，并构建系统进化树；采用RT-qPCR检测AmMETTL3在工蜂7个组织及5个不同发育时期的相对表达量。结果表明：成功克隆到AmMETTL3的CDS并发现AmMETTL3不含典型的跨膜结构域和信号肽；METTL3在各种昆虫中高度保守且含1个MT-A70结构域和3个相同的保守基序；AmMETTL3与东方蜜蜂METTL3的亲缘关系最近；相较于触角中的表达量，AmMETTL3的表达量在咽下腺中极显著上调（P<0.01），在中肠中极显著下调（P<0.01）;AmMETTL3在3日龄幼虫中的表达量极显著（P<0.01）低于卵中的表达量，在12日龄蛹中的表达量极显著（P<0.01）高于卵中的表达量，在2、6、12、15和18日龄工蜂体内的表达量极显著（P<0.01）低于1日龄工蜂体内的表达量。研究结果为深入探究AmMETTL3的功能及其参与的表观调控机制提供了参考和依据。

【目的】克隆中华蜜蜂（Ａｐｉｓ ｃｅｒＡｎＡ ｃｅｒＡｎＡ）的ｃ ＡＭｐ反应原件结合蛋白（ｃ ＡＭｐ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅＭｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｃｒｅｂ）基因全长ｃ ｄｎＡ序列，预测该基因及其编码蛋白的理化性质，并解析中华蜜蜂ｃｒｅｂ在大脑中的表达特征，为研究该基因在中华蜜蜂学习记忆过程中的生物学功能提供基础。【方法】以中华蜜蜂为试验材料，解剖其大脑获得脑组织，提取大脑组织的总ｒｎＡ。在此基础上，利用ｒｔ－ｐｃｒ技术克隆中华蜜蜂大脑的ｃｒｅｂ基因（Ａｃ ｃｒｅｂ），然后用ｄｎＡｓｔＡｒ软件中的ｓｅｑＭＡｎ程序将ｃｒｅｂ正反向测序后的序列拼接获得ｃｒｅｂ基因的ｃ ｄｎＡ序．．．

【目的】探究水曲柳光敏色素互作因子(FmPIFs)在激素调控与非生物胁迫应答过程中的重要作用,为揭示水曲柳抗逆分子机制和制定林木遗传育种策略提供理论依据。【方法】在水曲柳中克隆FmPIFs基因,并对其基因结构、蛋白质理化性质、保守基序、系统进化关系等进行生物信息学分析。采用qRT-PCR方法分析水曲柳中FmPIFs基因在不同组织及不同激素与胁迫条件下的表达模式。【结果】获得5个水曲柳FmPIFs基因家族成员,分别命名为FmPIF1、FmPIF3、FmPIF4、FmPIF7和FmPIF8,其对应的蛋白均为亲水性不稳定蛋白,全部定位在细胞核内。多序列比对结果表明FmPIFs均存在APB保守结构域,成员FmPIF1与FmPIF3存在特有的APA结构域。组织特异性分析显示FmPIFs均在叶中表达量最高,其中成员FmPIF8表达量最高,为对照的3.96倍;但在茎中少量表达,茎中表达量最高的是FmPIF3,仅是对照的0.21倍;而在根中表达量均极低。胁迫响应分析表明,FmPIFs正调控水曲柳植株盐、碱和干旱胁迫抗性,而对植株抗寒性起负调控作用,其中成员FmPIF3对寒冷及盐胁迫明显响应,FmPIF8在碱胁迫下表达量明显上调,FmPIF1在干旱胁迫下表达量明显上调。在激素响应结果中,FmPIFs对脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)和赤霉素(GA_3)的响应较为一致,而对生长素(IAA)和茉莉酸甲酯(MeJA)的响应存在差异。FmPIF1在施加MeJA后剧烈应答且表达量显著上调,FmPIF7在SA处理后表达量明显上调,FmPIF3和FmPIF4在GA3处理后表达量明显上调。【结论】FmPIFs各成员在基因及蛋白结构上表现出较高的一致性。RT-qPCR结果表明,FmPIFs在水曲柳叶片中表达量最高。在盐、碱、干旱和寒冷胁迫下,FmPIFs被诱导表达,且大部分表达模式相似。FmPIFs也在水曲柳响应IAA、ABA、MeJA、SA、GA3激素调控过程中发挥重要作用。

【目的】UDP-葡萄糖基转移酶家族基因（UGT）在植物次生代谢物的生物合成过程中起着重要的调控作用，本研究拟从栀子果实中克隆UGT基因家族成员UGT86A1和UGT85A2，对其进行生物学和表达模式分析，为阐明栀子中西红花苷合成调控机制奠定理论基础。【方法】基于栀子转录组功能注释结果，以栀子成熟果实c DNA为模板克隆目的基因，对其蛋白理化性质、信号肽和亚细胞定位预测、跨膜结构、基因结构、蛋白结构、空间结构以及不同物种中同源性对比进行分析；以栀子成熟果实DNA为模板，PCR扩增分别获得UGT86A1和UGT85A2基因组序列。利用实时荧光定量PCR技术对UGT86A1和UGT85A2基因在栀子不同部位及不同发育阶段果实的表达情况进行定量分析；采用高效液相色谱法（HPLC）测定栀子不同部位及不同发育阶段果实的西红花苷含量。【结果】克隆出的目的基因UGT86A1和UGT85A2大小分别为987、1 446 bp，其编码的氨基酸数目分别为328和481个，推测蛋白分子质量（MW）分别约为36.6和53.5 kD，理论等电点（pI）分别为5.23和5.06；预测UGT86A1氨基酸序列的N端具有信号肽酶切位点，切割位点位于18和19位氨基酸之间；预测UGT86A1与UGT85A2蛋白均为叶绿体蛋白；UGT86A1蛋白在91～286位氨基酸区域和UGT85A2蛋白在207～448位氨基酸区域均存在一个保守UDPGT结构域；系统进化树分析表明UGT86A1与UGT85A2均与同为茜草科的咖啡亲缘关系最近；PCR扩增UGT86A1和UGT85A2的基因大小分别为987和1 657 bp，基因结构分析表明UGT86A1基因不含内含子，UGT85A2基因含有两个外显子一个内含子；UGT86A1在栀子发育的不同阶段大致呈现递减式表达，而UGT85A2在栀子果实不同发育阶段则呈递增式表达；栀子不同发育阶段的西红花苷含量随着发育的不断成熟而增加。【结论】栀子UGT基因家族中的UGT85A2基因表达模式与西红花苷含量积累无显著相关，而UGT86A1基因表达模式与西红花苷积累呈显著负相关，推测其可能在西红花苷合成中发挥负调控作用。该结论可为下一步基因功能验证及其合成机理解析提供参考。

以团头鲂为研究对象,扩增获得Junctophilin(Jph)家族4个成员,jph1a、jph1b、jph2和jph3的cDNA编码序列,分别为2 031、2 016、2 358和2361 bp,分别编码676、671、785和786 aa。团头鲂jphs均由5个外显子和4个内含子组成,与大多数物种的JPHs基因结构相似;结构域预测显示出8个MORN和1个TM结构域,且蛋白多序列比对分析显示Jphs在进化上非常保守。基于qRT-PCR(quantitative real-time PCR)分析显示,这4个基因呈现出组织特异性表达,其中jph1a、jph1b和jph2主要在肌肉和心脏中表达,而jph3主要表达于心脏、血液和大脑。在早期发育过程中,jph1a、jph1b、jph2和jph3的mRNA表达模式类似,分别在原肠胚期、心跳期和25 dph(days post hatching)达到高峰。综上研究结果表明,鱼类jphs基因在心脏和肌肉等组织中发挥重要作用,并且其功能可能不同于哺乳动物。

【目的】克隆、分析和原核表达编码中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2的cDNA。【方法】以13个不同日龄中华蜜蜂工蜂触角为材料,通过RT-PCR技术以获得编码中华蜜蜂Apis cerana cerana气味结合蛋白ASP2基因成熟蛋白开放阅读框序列,并在pET-30a(+)/BL21(DE3)系统中进行原核表达。【结果】克隆了命名为Acer-ASP2(GenBank登录号:DQ449667)的中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2基因,该序列全长429bp,编码142个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为15.7kD和4.36。预测蛋白具有昆虫气味结合蛋白典型的6个保守的半胱氨酸残基的特征,进一步分析表明Ace...

【目的】克隆获得中华蜜蜂（Ａｐｉｓ ｃｅｒＡｎＡ ｃｅｒＡｎＡ）Ａｃｅｒ ＯＢｐ１４基因序列，并对其蛋白结构进行预测，分析其在不同组织和发育阶段的时空表达差异，为该基因的功能研究提供参考。【方法】以中华蜜蜂全组织ｃ ＤｎＡ为模板利用ｒＴ－ｐｃｒ技术扩增和克隆获得Ａｃｅｒ ＯＢｐ１４ ｃ ＤｎＡ全长序列，并提交至Ｇｅｎ ＢＡｎｋ数据库；利用多种生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征；采用ＭｅＧＡ５．２软件中的邻位相连法（ｎｅｉＧｈＢＯｒ－ｊＯｉｎｉｎＧ，ｎｊ）构建Ａｃｅｒ ＯＢｐ１４及其同源膜翅目昆虫ＯＢｐｓ的系统发育树；通过实时荧光定量ｐｃｒ技术分析Ａｃｅｒ ＯＢｐ１４在１、５、．．．

【目的】含有AP2结构域的AP2/ERF蛋白是与植物抗逆性密切相关的转录因子家族,Soloist是AP2/ERF家族中的孤儿基因,大部分植物只有1个。克隆麻疯树该基因编码框的全长c DNA序列,并对其理化性质、基因结构、启动子区域调控元件、表达特性及蛋白原核表达进行分析,为深入开展麻疯树Soloist基因的功能鉴定及其在麻疯树遗传改良中的应用提供依据。【方法】利用AP2结构域的隐马尔可夫模型结合拟南芥与水稻的Soloist蛋白序列对麻疯树蛋白质数据库进行相似性检索,经过Pfam与CDD在线工具的验证获得麻疯树AP2/ERF基因家族成员。利用不同的工具对Soloist基因进行生物信息学对比分析。通过实时荧光定量PCR检测该基因在麻疯树不同器官及低温处理下的相对表达量。通过双酶切构建该基因的原核表达载体,并转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行IPTG诱导表达,分别收集不同诱导时间段的菌液,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况。【结果】共鉴定到119个麻疯树AP2/ERF家族基因,其中包含1个Soloist基因,命名为Jc Soloist。序列分析显示,麻疯树Jc Soloist基因编码框长度为699 bp,编码232个氨基酸,预测分子量为26.3 k Da,理论等电点为9.65,包含6个外显子与5个内含子。在其基因启动子序列中鉴定到TATA框、CAAT框,以及赤霉素、水杨酸及干旱等应答元件。表达分析显示,麻疯树Jc Soloist基因在麻疯树各器官中都有表达,但表达水平具有器官特异性,在根中表达量较高,而在叶片中表达量相对较低,同时,在叶片与根中都属于低温诱导表达基因,分别在低温胁迫3 h与24 h达到最大表达量,较对照提高34.38倍与3.83倍。构建了p ET-32a-Jc Soloist重组载体,且在原核细胞中稳定表达,SDS-PAGE结果显示融合蛋白分子量为46.0 k Da,与预期大小一致。【结论】麻疯树AP2/ERF基因家族鉴定到1个Soloist基因,包含由3条反平行β-折叠与1条α-螺旋组成的AP2结构域,与其他物种的报道一致。基因启动子区域鉴定到赤霉素、水杨酸等顺式作用元件,暗示该基因在麻疯树激素信号转导中发挥重要作用。Jc Soloist基因在麻疯树叶片与根中受低温诱导表达显著,说明该基因参与麻疯树低温响应过程以及低温信号转导途径,也成为麻疯树抗冷新品种选育的候选基因。

为研究查尔酮合成酶基因(CHS)家族在‘无子瓯柑’ Citrus suavissima ‘Seedless’雄性不育发生过程中的作用,以克里曼丁橘Citrus clementina基因组数据库为参照,在‘无子瓯柑’和瓯柑Citrus suavissima的转录组和蛋白质组测序结果中筛选出4个CHS同源差异表达基因,并对其克隆和表达量分析,对克里曼丁橘CHS基因家族成员进行生物信息学分析。结果表明:‘无子瓯柑’和瓯柑CHS基因编码区核苷酸序列相似度达98%以上。小孢子母细胞发育各时期CHS基因表达量在瓯柑和‘无子瓯柑’间差异显著。与瓯柑相比,‘无子瓯柑’小孢子母细胞时期Ciclev10005133m, Ciclev10030093m和Ciclev10015535m的表达量显著下调;减数分裂时期Ciclev10005133m,Ciclev10001405m和Ciclev10015535m的表达量显著下调;四分体时期Ciclev10001405m和Ciclev10030093m的表达量显著减少。在花粉粒成熟时期的花蕾中,Ciclev10001405m与Ciclev10005133m在花药中特异性表达。CHS同源基因在花药不同时期中的差异表达可能是‘无子瓯柑’花药发育异常的重要原因,并最终导致‘无子瓯柑’雄性不育。图3表6参15

【目的】YABBY是高等植物中特有的转录因子家族,在侧生器官发育和开花过程中发挥重要作用。本研究对毛白杨PtYABBY基因进行克隆和生物信息学分析,并对雌雄花芽8个关键发育时期和根茎叶等组织中PtYABBY基因表达模式进行探究,以期为阐明PtYABBY基因在毛白杨侧生器官发育过程中的功能奠定前期基础。【方法】以毛白杨为试材,采用同源基因克隆法从毛白杨中分离FILAMENTOUS FLOWER (FIL)/YABBY3 (YAB3)同源基因PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11的编码区序列,并开展生物信息学分析。通过qRT-PCR研究这3个基因在雌雄花芽8个发育时期及根、茎、幼叶、成熟叶片中的表达规律。【结果】PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11编码区长度分别为633、642、639 bp,分别编码210、213、212个氨基酸。所推测的氨基酸序列包含C_2C_2锌指结构域和YABBY结构域。系统进化分析进一步表明这3个基因属于FIL/YAB3亚家族成员。qRT-PCR结果显示这3个基因在根、茎、叶及8个时期雌雄花芽组织中均有表达,但PtYABBY基因间的表达水平存在明显差异。PtYABBY3表达水平在雌雄花芽发育初期下调,发育后期上调;花原基形成到休眠期内PtYABBY3在雌雄花芽中呈现相反的表达变化趋势。PtYABBY4和PtYABBY11基因在雌雄株成花诱导期表达水平最高,成花诱导到伸长期内呈现下降趋势,在雄花芽休眠期和小孢子发生期基因表达水平无明显变化。营养组织表达量测定结果显示这3个基因在幼叶和成熟叶片中表达水平相对较高,根系中表达量最低。【结论】YABBY基因家族成员PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11同属FIL/YAB3亚类,在毛白杨雌雄花芽发育的8个时期中表达水平存在较大差异,且在叶片和花芽中表达量较高,表明其可能与叶片和花芽发育相关。本研究为今后深入研究YABBY家族成员在杨树器官生长发育过程中的作用奠定基础。

【目的】从普通烟草中分离更多CDPK基因,分析该基因家族的序列特征、进化关系和表达谱,为全面揭示其功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR、RACE和生物信息学的方法,分离普通烟草CDPK基因;采用MEGA4.0软件构建系统进化树;利用RT-PCR研究普通烟草全长基因的表达谱。【结果】分离到普通烟草CDPK基因8个,其中3个可以找到完整的开放读码框;系统进化树分析显示,烟草属11个全长CDPK基因位于4个亚家族,预测的2对普通烟草和拟南芥的直系同源基因在功能上可能非常保守;3个普通烟草全长基因虽然在所有的组织中都能检测到,但是它们的表达谱在不同的组织间存在明显差异。【结论】分离到8个未报道的普通...

山鸡椒(Litsea cubeba(Lour.)Pers)是我国重要的天然香料树种,以果实为主要原料提取的山鸡椒精油在化工业、农业、制药业等行业有广泛应用,供不应求。山鸡椒精油主要成分萜类物质的合成途径及关键基因暂不清楚,萜类合成通路关键酶的研究可以为品种的遗传改良提供基因资源。山鸡椒精油以单萜与倍半萜为主要活性物质,目前在山鸡椒萜类合成通路上已陆续有关键酶基因被克隆鉴定,但其中具有竞争性关键调控作用的异戊烯基转移酶(IPS)尚缺乏了解。本研究基于山鸡椒果实发育过程的转录组数据,鉴定了来自LcIPS三个基