为探究中华蜜蜂磁响应基因的生物学功能，提取中华蜜蜂Apis cerana cerana(简称中蜂)总RNA,反转录制备cDNA,用特异性引物PCR扩增AcMagR和AcCry2基因的CDS序列，利用生物信息学软件对其功能结构域、系统进化树等进行分析；采用实时荧光定量PCR技术(qPCR)分析中蜂工蜂不同日龄(1、5、10、15、20、25、30日龄)和不同组织(头部、胸部和腹部)中AcMagR和AcCry2基因的相对表达量.结果表明，中蜂AcMagR和AcCry2基因的ORF序列长分别为393、1 713 bp,分别编码130、570个氨基酸.AcMagR蛋白存在1个Fe-S＿biosyn功能结构域，AcCry2蛋白则具有2个功能结构域(DNA＿photolyase和FAD＿binding＿7).系统发育树显示，中蜂AcMagR、AcCry2基因与西方蜜蜂关系最近，它们再进一步与小蜜蜂和大蜜蜂聚为一支.荧光定量PCR结果表明，AcMagR和AcCry2基因在不同日龄工蜂胸部的表达量显著高于头部和腹部，且在采集蜂胸部中表达量最高，该结果表明这两个基因在蜜蜂的采集飞行活动中发挥着重要作用.

【目的】克隆中华蜜蜂（Ａｐｉｓ ｃｅｒＡｎＡ ｃｅｒＡｎＡ）的ｃ ＡＭｐ反应原件结合蛋白（ｃ ＡＭｐ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅＭｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｃｒｅｂ）基因全长ｃ ｄｎＡ序列，预测该基因及其编码蛋白的理化性质，并解析中华蜜蜂ｃｒｅｂ在大脑中的表达特征，为研究该基因在中华蜜蜂学习记忆过程中的生物学功能提供基础。【方法】以中华蜜蜂为试验材料，解剖其大脑获得脑组织，提取大脑组织的总ｒｎＡ。在此基础上，利用ｒｔ－ｐｃｒ技术克隆中华蜜蜂大脑的ｃｒｅｂ基因（Ａｃ ｃｒｅｂ），然后用ｄｎＡｓｔＡｒ软件中的ｓｅｑＭＡｎ程序将ｃｒｅｂ正反向测序后的序列拼接获得ｃｒｅｂ基因的ｃ ｄｎＡ序．．．

【目的】克隆获得中华蜜蜂（Ａｐｉｓ ｃｅｒＡｎＡ ｃｅｒＡｎＡ）Ａｃｅｒ ＯＢｐ１４基因序列，并对其蛋白结构进行预测，分析其在不同组织和发育阶段的时空表达差异，为该基因的功能研究提供参考。【方法】以中华蜜蜂全组织ｃ ＤｎＡ为模板利用ｒＴ－ｐｃｒ技术扩增和克隆获得Ａｃｅｒ ＯＢｐ１４ ｃ ＤｎＡ全长序列，并提交至Ｇｅｎ ＢＡｎｋ数据库；利用多种生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征；采用ＭｅＧＡ５．２软件中的邻位相连法（ｎｅｉＧｈＢＯｒ－ｊＯｉｎｉｎＧ，ｎｊ）构建Ａｃｅｒ ＯＢｐ１４及其同源膜翅目昆虫ＯＢｐｓ的系统发育树；通过实时荧光定量ｐｃｒ技术分析Ａｃｅｒ ＯＢｐ１４在１、５、．．．

【背景】作为我国本土重要的资源昆虫，中华蜜蜂（Apis cerana cerana，简称中蜂）对我国初冬季低温开花植物的传粉具有重要的生态价值，其传粉习性与嗅觉系统密切相关。前期对中蜂采集蜂高、低温处理后的触角转录组数据分析发现，与昆虫嗅觉相关的尼曼匹克C2型蛋白（Niemann-Pick type C2 protein,NPC2）基因家族在低温时表达量上升。【目的】以中蜂NPC2家族基因为研究对象，克隆并分析其结构特征和表达谱以及高、低温处理下表达量的差异，为深入研究中蜂NPC2基因家族在中蜂低温适应的嗅觉感受功能提供参考。【方法】基于中蜂高、低温转录组测序结果，利用RT-PCR克隆获得中蜂NPC2基因ORF序列，进行系统进化树分析和三维结构预测，然后通过实时荧光定量PCR分析中蜂NPC2基因在不同发育时期、组织的时空表达谱，以及高、低温时的表达量变化。【结果】获得4个中蜂NPC2基因——AcNPC2a、AcNPC2b、AcNPC2c、AcNPC2d的ORF全长，分别为447、480、459和465 bp，编码148、159、152和154个氨基酸，预测蛋白分子量为16.12—18.53 kD，等电点分别为7.98、7.57、6.56和6.34。进化树分析显示AcNPC2与意大利蜜蜂的NPC2同源序列亲缘关系最近，与其他膜翅目昆虫NPC2也有一定相似性。实时荧光定量PCR结果显示，AcNPC2a在新出房蜂的腹部表达量最高，其次是在哺育蜂的腹部以及幼虫期；AcNPC2b在新出房蜂的胸部表达最高，在采集蜂的头部、胸部和后足也有表达；AcNPC2c在哺育蜂和采集蜂的触角中呈高丰度表达；AcNPC2d在采集蜂的头部表达量最高。经低温处理后，4个AcNPC2基因在采集蜂触角中的表达量均有所上升，但差异不显著。【结论】AcNPC2具有NPC2蛋白的保守结构，其基因家族成员在中蜂的时空表达谱中呈现多样性，其中AcNPC2c在触角中呈高丰度表达，表明其与中蜂嗅觉感受功能关系密切。AcNPC2基因家族在低温时采集蜂触角中表达量均有所上升，表明该基因家族有可能参与中蜂的低温适应性，或与初冬季访花行为有关。

【目的】克隆、分析和原核表达编码中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2的cDNA。【方法】以13个不同日龄中华蜜蜂工蜂触角为材料,通过RT-PCR技术以获得编码中华蜜蜂Apis cerana cerana气味结合蛋白ASP2基因成熟蛋白开放阅读框序列,并在pET-30a(+)/BL21(DE3)系统中进行原核表达。【结果】克隆了命名为Acer-ASP2(GenBank登录号:DQ449667)的中华蜜蜂气味结合蛋白ASP2基因,该序列全长429bp,编码142个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为15.7kD和4.36。预测蛋白具有昆虫气味结合蛋白典型的6个保守的半胱氨酸残基的特征,进一步分析表明Ace...

【目的】完成中华蜜蜂(Apis cerana cerana)化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)基因家族的序列及表达谱鉴定,解析中蜂整个CSPs家族的表达特征与分布规律,为中蜂CSPs的生物学功能研究提供参考。【方法】利用RT-PCR技术扩增,克隆获得中蜂CSPs基因家族全部6条基因序列的开放阅读框(ORF)全长,并利用real-time PCR技术对中蜂所有的CSPs序列在中蜂工蜂不同发育历期及不同器官表达特征进行研究。【结果】新克隆4条基因(Ac-CSP2、Ac-CSP4、Ac-CSP5和Ac-CSP6)的开放阅读框分别为354、387、315和378 bp...

为克隆意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）的AmMETTL3基因，解析AmMETTL3蛋白的分子特性，并测定AmMETTL3在工蜂不同组织及发育时期的表达谱。通过PCR扩增AmMETTL3的CDS并进行Sanger测序验证；使用相关生物信息学软件预测AmMETTL3的理化性质和分子特性，鉴定METTL3的结构域和保守基序，并构建系统进化树；采用RT-qPCR检测AmMETTL3在工蜂7个组织及5个不同发育时期的相对表达量。结果表明：成功克隆到AmMETTL3的CDS并发现AmMETTL3不含典型的跨膜结构域和信号肽；METTL3在各种昆虫中高度保守且含1个MT-A70结构域和3个相同的保守基序；AmMETTL3与东方蜜蜂METTL3的亲缘关系最近；相较于触角中的表达量，AmMETTL3的表达量在咽下腺中极显著上调（P<0.01），在中肠中极显著下调（P<0.01）;AmMETTL3在3日龄幼虫中的表达量极显著（P<0.01）低于卵中的表达量，在12日龄蛹中的表达量极显著（P<0.01）高于卵中的表达量，在2、6、12、15和18日龄工蜂体内的表达量极显著（P<0.01）低于1日龄工蜂体内的表达量。研究结果为深入探究AmMETTL3的功能及其参与的表观调控机制提供了参考和依据。

［目的］通过表达载体ｐ ＥＴ－２８ａ（＋）在大肠杆菌中克隆表达蜜蜂螺原体ＳｐｉｒｏｐｌａＳｍａ ｍＥｌｌｉｆＥｒｕｍ ＣＨ－１中可能与致病相关的几丁质脱乙酰酶（ＣＨｉＴｉｎ ｄＥａＣＥＴｙｌａＳＥ，Ｃｄａ）基因ＣＨｉｄ，并测定其部分酶学性质，为进一步研究该基因在蜜蜂螺原体致病过程中的作用奠定基础。［方法］利用ｏｖＥｒｌａｐ ＥｘＴＥｎＳｉｏｎ ｐＣｒ（ｏＥ－ｐＣｒ）定点突变技术，在引物设计时插入目的突变，通过３次ｐＣｒ获得突变后的目的片段，测序验证后构建重组质粒ｐ ＥＴＣＨｉｄ，挑取ＢｌＣＨｉｄ表达菌株。ｉｐＴＧ诱导表达目的蛋白，ｎＴａ－ｎｉ２＋柱纯化，ＷＥＳＴＥｒｎ ＢｌｏＴＴｉｎＧ验证，紫．．．

根据已知Btcry8类基因的全长序列设计一对特异性引物JJX5和JJX3,以Bt菌株B-DLL的质粒DNA为模板扩增出3.5 kb大小的片段;将该片段插入大肠杆菌表达载体pET-21b中,并完成了该片段的全序列测定。该基因编码区为3 495 bp,编码的蛋白质由1 164个氨基酸残基组成,相对分子质量为131.8 kDa,等电点为pH 4.71,为弱酸性蛋白。该基因(GenBank:EU047597)编码的氨基酸序列与Cry8Ea1的氨基酸序列同源性高达99.31%,被国际Bt基因命名委员会正式命名为cry8Ea2。经IPTG诱导后该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够正常表达130 kDa...

为了解NR5a2在中华鳖(Pelodiscus sinensis)性腺分化过程中的作用,通过RACE技术克隆获得中华鳖NR5a2 cDNA。结果显示:该基因序列全长为2 674 bp,开放阅读框为1 608 bp,编码535个氨基酸,5′非编码区长度为40 bp,3′非编码区长度为1 026 bp。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白质分子质量为60.5 ku,等电点为8.57,具有保守的ZnF-C4结构域和HOLI结构域。氨基酸多重序列比对分析表明中华鳖NR5a2基因与西部锦龟(Chrysemys picta bellii)的相似性最高,其次是原鸡(Gallus gallus)。系统进化分析表明中华鳖NR5a2与西部锦龟的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明NR5a2在中华鳖不同组织中均有表达,且卵巢组织中的表达量显著高于精巢组织。31.5℃孵化条件下,不同发育时期的中华鳖胚胎组织中发现NR5a2基因在17期时表达量达到最高,随后显著下降。结果表明NR5a2可能参与中华鳖的性别分化。

【目的】从乌菜(Brassica campestris L.)中克隆VIN3-LIKE 2 (VIL2)基因并进行生物信息学与表达分析，为进一步研究BcVIL2基因功能奠定基础。【方法】以‘徽乌19’为试验材料，利用同源克隆等技术获得BcVIL2基因，对其序列进行蛋白分子量(MW)、糖基化位点、二级结构等生物信息学分析；利用荧光定量PCR等技术分析其应答春化表达模式。【结果】BcVIL2基因ORF (Open reading fragment)全长为1296 bp，共编码431个氨基酸，属于亲水性蛋白，预测含有1个潜在的糖基化位点和59个潜在的磷酸化位点，蛋白分子量为47.91 kDa，理论等电点(pI)为8.27；其二级结构主要由α-螺旋与无规则卷曲组成；亚细胞定位预测其可能在细胞核中发挥作用；同源序列比对分析显示该基因与芸薹属植物VIL2基因同源性较高；亲缘进化树分析也显示该基因与白菜(B. rapa， syn. B. campestris)和芥菜(B. juncea) VIL2基因亲缘关系很近；荧光定量PCR结果表明，盛花期时BcVIL2基因在根中表达量最低，在荚中表达量最高，而叶中表达量显著低于茎和花中表达量；一月苗龄植株春化后BcVIL2基因的表达量显著低于未春化时的表达量。【结论】乌菜VIL2基因响应春化负表达，与春化反应相关基因BraA01g032910.3C、BraA05g026410.3C与BraA10g016160.3C密切相关，可能存在互作关系，本研究结果为深入分析BcVIL2基因的功能提供了良好基础。

[目的]探究红光熊蜂低温胁迫不同时间、不同温度下GS、Akt2基因的表达差异,为研究红光熊蜂抵御低温胁迫的分子机制提供参考。[方法]以RT-PCR结合RACE技术,克隆、测序红光熊蜂GS、Akt2基因,通过ORF Finder、Prot Param和TBtools等生物信息学软件预测红光熊蜂GS和Akt2蛋白的结构、理化特性以及染色体定位等信息;设计GS、Akt2基因特异性引物,采用实时荧光定量PCR技术检测不同温度、不同处理时间下GS、Akt2基因相对表达量的差异。[结果]红光熊蜂GS基因全长1 417 bp,开放阅读框(ORF)1 020 bp,编码339个氨基酸;GS蛋白二级结构包括无规则卷曲(51.92%)、α-螺旋(23.89%)、延伸链(12.09%)和β-转角(12.09%),具有12个Ser、6个Thr、2个Tyr,可能为GS蛋白激酶磷酸化位点。Akt2基因全长926 bp,ORF为837 bp,编码278个氨基酸;Akt2蛋白二级结构包括α-螺旋(34.89%)、无规则卷曲(33.45%)、延伸链(23.74%)和β-转角(7.91%),具有7个Ser、8个Thr、5个Tyr,可能成为Akt2蛋白激酶磷酸化位点。亚细胞定位GS、Akt2蛋白均存在于线粒体中,为亲水性蛋白,且无信号肽序列,故均为非分泌蛋白。GS、Akt2基因分别位于红光熊蜂1H和3H号染色体上。5～25℃时,红光熊蜂GS基因相对表达量随温度降低而显著下调,而Akt2基因相对表达量则随温度降低呈明显上升趋势,且15℃时其相对表达量显著升高,5℃达到峰值。8℃低温胁迫不同时间,随胁迫时间延长,GS基因相对表达量显著下降;而Akt2基因的相对表达量显著升高,且胁迫12 h达到峰值,随后其相对表达量随胁迫时间延长而缓慢恢复。[结论]红光熊蜂GS、Akt2基因可能通过调控PI3K/Akt或Mtor/FoxO通路以抵御低温胁迫。

【目的】研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana)抗菌肽Apidaecin在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中的重组表达,并验证纯化后的重组抗菌肽Apidaecin在体内和体外是否具有抗菌活性,为开发新型、安全具有抗菌和免疫调节功能的抗菌肽制剂提供理论依据。【方法】以意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)Apidaecin为模板,克隆出中华蜜蜂抗菌肽Apidaecin,成功构建his-pHT43/Apidaecin表达载体,并参照MoBiTec所提供的制备方法成功制得枯草芽孢杆菌感受态细胞,现配现用,以保证其活性并得以在枯草芽孢杆菌表达系统中重组表达。使用His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)进行表达蛋白的分离纯化,使用Easy II Protein QuantitativeKit(BCA)试剂盒测定浓度。纯化得到的重组抗菌肽Apidaecin作用于大肠杆菌K88,在体外进行抑菌圈试验和最小浓度抑菌法测定;在体内,以小鼠为试验动物模型,试验组小鼠腹腔注射重组抗菌肽Apidaecin,阴性对照组注射相同体积的生理盐水,阳性对照组注射相同体积的头孢霉素,然后人为感染大肠杆菌K88,感染24 h后对小鼠进行解剖,取得肠道样品和血液样品,并从肠道屏障和免疫功能两个方面探讨重组抗菌肽Apidaecin对感染大肠杆菌K88小鼠的保护作用。使用ELISA试剂盒对染菌小鼠血清免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)与肠道sIgA水平进行测定,采用qRT-PCR法对小鼠肠道紧密连接蛋白基因(claudin-1、ZO-2)以及小鼠肠道细胞因子(促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL6和抑炎因子IL10)的转录水平进行测定。【结果】克隆得到的中华蜜蜂Apidaecin含有183bp的碱基,编码60个氨基酸,包含Apidaecin的信号肽序列、一个基础的RR二肽以及抗菌肽Apidaecin的氨基酸序列(内含高度保守的8个氨基酸序列),编码的蛋白质命名为AccApidaecin,其分子量为15.6 kD,等电点为5.33。在IPTG终浓度为3 mmol·L~(-1),诱导温度为30℃,诱导表达12 h后,可从1 L表达上清中纯化得到约20 mg抗菌肽。药敏试验显示,重组抗菌肽Apidaecin在体外与阴性对照相比有明显抑菌圈出现,且测得的最小抑菌浓度为10 mg·L~(-1);在小鼠体内,腹腔注射重组抗菌肽Apidaecin的染菌试验组与注射生理盐水的染菌试验组相比免疫球蛋白含量差异显著(P<0.05),说明腹腔注射重组抗菌肽Apidaecin能够有效缓解由大肠杆菌K88引起的小鼠免疫球蛋白含量的增加;同时,小鼠肠道相关蛋白的基因表达量也差异显著(P<0.05),说明重组抗菌肽Apidaecin能够有效保护被大肠杆菌K88侵染的小鼠肠道。【结论】在枯草芽孢杆菌中能够成功重组表达中华蜜蜂抗菌肽Apidaecin,并且纯化后的中华蜜蜂抗菌肽Apidaecin在体外对大肠杆菌K88有良好的抗菌效果;经腹腔注射进入小鼠体内,能够提高小鼠的免疫机能,有效抵抗大肠杆菌K88对小鼠的侵染。

以本实验室分离的Bt菌株B-DLL质粒DNA为模板,利用cry8类基因特异性引物JJX5和JJX3扩增出3.5kb的片段,将该片段插入克隆载体pMD 18-T中,筛选获得一个含新基因的克隆pMD-cry8new。序列测定表明,该基因编码区为3 525 bp,编码的蛋白质由1 174个氨基酸残基组成,理论分子量为133.05 kDa,等电点为pH4.69,为弱酸性蛋白。该基因核苷酸序列已在GenBank登录(Accession number:HQ174208),编码的氨基酸序列与Cry8Fa1的同源性最高达99.8%,被国际Btδ-内毒素命名委员会正式命名为Cry8Fa2。将cry8Fa2基因插...

【目的】昆虫气味受体(odorant receptors,Ors)在其发挥嗅觉识别过程中采用的是配体门控离子通道信号传导机制,这一离子通道是由一个特定的共受体与一个普通气味受体结合为异源二聚体而形成的。其中,气味共受体(odorant receptor coreceptor,Orco)是一个十分独特的家族,在不同种类昆虫中高度保守,并在调控昆虫的嗅觉行为方面发挥关键作用。论文在对中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)工蜂Orco研究基础之上,进一步探讨雄蜂Orco的表达特性。【方法】采集中蜂1日龄雄蜂的触角、头(去除触角)、胸、腹、足5部分组织,以及不同发育阶段的幼虫、蛹及...