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[期刊] 中国水产科学
[作者]
郭豫杰 周开亚 马长艳
蜕皮抑制激素(molt-inhibitinghormone,MIH)属甲壳动物高血糖激素(crustaceanhyperglycemichormone,CHH)家族。MIH抑制Y 器官蜕皮激素的合成。以中华绒螯蟹(Eriocheirjaponicasinensis)眼柄总RNA为模板,根据中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Eriocheirjaponicasinensismolt inhibitinghormone 1,Ers MIH1)基因序列设计引物,用RT PCR的方法获得了Ers MIH1基因成熟肽的cDNA片段。序列分析表明,Ers MIH1基因成熟肽编码区含有228bp,编码75个氨基酸残...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
宋霞 周开亚 马长艳
根据其他蟹类蜕皮抑制激素的氨基酸序列设计了简并引物,运用RT PCR和RACE技术,从中华绒螯蟹(E riocheirjaponicasinensis)成体的蜕皮间期眼柄中,克隆了1条长1145bp的cDNA。该cDNA编码60个氨基酸,包括942bp的3′端非翻译区。同源性分析结果表明,该cDNA编码的氨基酸序列和其他蟹类蜕皮抑制激素有较高的一致性,最高的一致性为64%,将获得的序列命名为中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因(GenBank检索号:AY309062)。用Northern印迹分析的方法对处于各个发育阶段的胚胎及状幼体期该基因的表达进行了研究,结果表明,处于胚胎发育早期的卵裂期几乎没有...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
陆钟岩 冯金叶 宋大祥 马长艳 郭豫杰 周开亚
扩增中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)卵巢EJO1基因(GenBank检索号:AY185917)的cDNA全序列得到编码区序列,并将其插入原核表达载体pET28b中,构建成表达质粒pET28b-EJO1。该表达质粒在大肠杆菌(Esche-richia coli)BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到EJO1-H IS6融合蛋白。SDS-PAGE电泳分析表明,该融合蛋白的相对分子质量约为32 000。经镍离子柱亲和层析进一步纯化得到纯度较高的EJO1-H IS6融合蛋白。
[期刊] 华北农学报
[作者]
付振艳 张正斌 王晓军 徐萍
NADP依赖的苹果酸酶(NADP-ME)是C4光合途径关键酶。为了确定TaNADP-ME1基因的功能,利用重组技术将前期克隆到的TaNADP-ME1基因构建到原核表达载体pET32a,双酶切和PCR鉴定阳性克隆,CaCl2法转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导融合蛋白表达,Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白。成功获得了重组原核表达载体pETE1,TaNADP-ME1基因在BL21(DE3)pLysS中得到了融合表达,SDS-PAGE表明,融合蛋白分子量为80 kDa,并成功纯化到融合蛋白。
[期刊] 华北农学报
[作者]
张雪寒 何孔旺 卢维彩 赵攀登 温立斌 李彬 郭容利 王小敏 倪艳秀 周俊明 俞正玉 茅爱华 吕立新
为了更好防治由出血性大肠杆菌O157∶H7引起的疾病,尝试研制基因工程疫苗,其中亚单位疫苗时具有很大优势。构建表达tir和stx1b的融合基因,将tir基因中间295个氨基酸残基(Tir295)与stx1b亚基基因72个氨基酸串联构建pGEX-stx2b-tir-stx1b重组质粒,将其转化于BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了高效表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30%左右。重组蛋白纯化后皮下途径免疫小鼠,能够诱导高滴度(105)的IgG,鼻腔内途径免疫小鼠不仅能够诱导高滴度(104)的IgG,还能诱导高达102的IgA。二免后攻击50...
[期刊] 水产学报
[作者]
宫磊 张亦陈 孙妍 刘逸尘 耿绪云 孙金生
蜕皮激素受体(ecdysteroid receptor,EcR)介导调控甲壳动物蜕皮生长、附肢再生等重要生命活动。为了解EcR在人工控制甲壳动物的繁殖和生长中的作用,采用RACE方法结合同源克隆技术,首次从中华绒螯蟹Y-器官中克隆得到蜕皮激素受体基因全长cDNA序列(Ers-EcR,登录号:KF736985),并进行了结构解析和组织表达分析。结果发现,Ers-EcR编码基因全长2 176 bp,开放阅读框为1 638 bp,编码545个氨基酸,具有DNA结合域(DBD)和配体结合域(LBD)等典型的核受体超家族结构域,但不具有信号肽结构。其中,DBD含有8个保守的Cys残基,可以形成2个锌指结...
关键词：
中华绒螯蟹 蜕皮激素受体 克隆 表达
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
凌雯 龚晓明 杨震 杜念兴
应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）对畜型和禽型两个融合基因ＨＢｓＡｇ／ＬＨＲＨ的５′端分别作了改造，切去了融合基因起始密码ＡＴＧ前一段非编码序列６１个碱基，将改造后的融合基因插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｅ１１ＫＳ＋质粒中。琼脂糖凝胶电泳以及序列分析均表明改造和克隆成功。将改造后的融合基因克隆到含Ｔ７Ｐｒｏｍｏｔｅｒ强启动子的表达载体ｐＥＴ１５ｂ中，经异丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导，在Ｅ．ｃｏｌｉＤＥ３中表达，表达量占菌体总蛋白的１０％，以兔抗ＬＨＲＨ抗体进行Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测，出现阳性反应带。用抗ＨＢｓＡｇ抗体作ＥＬＩＳＡ检测，结果稀释１×１０－６时仍为阳性反应。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
戴珊 赵燕 刘芬 滕慧 张学文
以pET–30a和pEGX为出发载体，构建牛乳铁蛋白功能片段BlfFf基因工程表达的非融合性表达质粒pET–BlfFf和和融合性表达质粒pEGX–BlfFf，并在大肠杆菌BL21中诱导了蛋白表达。表达产物经SDS–PAGE分析，非融合型表达pET–BlfFf导表达的目标蛋白主要以包涵体形式存在，而融合型的pEGX–BlfFf表达的目标蛋白则可大量溶于细胞破碎上清液中，说明后者更适合表达可溶性目标蛋白。pEGX–BlfFf诱导表达产物经GST标签填料柱亲和层析纯化后，可制备出可溶性融合蛋白GST–BlfFf，其产量约为60 mg/L。该蛋白经凝血酶去除GST标签，获得纯化的目标肽BlfFf。对BlfFf的生物活性的试验表明，经过胃蛋白酶水解后的多肽对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有抗菌活性。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
戴珊 赵燕 刘芬 滕慧 张学文
以pET–30a和pEGX为出发载体，构建牛乳铁蛋白功能片段BlfFf基因工程表达的非融合性表达质粒pET–BlfFf和和融合性表达质粒pEGX–BlfFf，并在大肠杆菌BL21中诱导了蛋白表达。表达产物经SDS–PAGE分析，非融合型表达pET–BlfFf导表达的目标蛋白主要以包涵体形式存在，而融合型的pEGX–BlfFf表达的目标蛋白则可大量溶于细胞破碎上清液中，说明后者更适合表达可溶性目标蛋白。pEGX–BlfFf诱导表达产物经GST标签填料柱亲和层析纯化后，可制备出可溶性融合蛋白GST–BlfFf，其产量约为60 mg/L。该蛋白经凝血酶去除GST标签，获得纯化的目标肽BlfFf。对BlfFf的生物活性的试验表明，经过胃蛋白酶水解后的多肽对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有抗菌活性。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张劲 郭霭光 丰美福
β2微球蛋白(β2m)是主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ类分子的轻链部分,该蛋白的原核表达与纯化是制备MHC-Ⅰ类分子的首要条件。利用已经构建好的β2m原核表达载体pET 23a+β2m,在大肠杆菌(E.coli)中获得稳定表达。原核表达的β2m大部分在包涵体中,包涵体蛋白经充分洗涤、变性(尿素溶解)和复性,并以强阴离子交换柱层析(Q-Sepharose)纯化,获得SDS-PAGE纯的人重组β2m,W estern印迹法分析表明,该蛋白具有与抗人天然β2m抗体反应的特性。
关键词：
β2微球蛋白 重组蛋白 包涵体 复性
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
曹晓风 赵武玲 吴玮 阎隆飞
高等植物细胞内含有肌动蛋白 ,但含量较低 ,难于提取及进行进一步研究。我们用 PCR的方法扩增肌动蛋白 c DNA,并克隆到表达质粒 p Trp His,然后转化大肠杆菌 DH5α;在 IPTG诱导下 ,肌动蛋白表达在包涵体中 ,在没有 IPTG诱导时 ,肌动蛋白表达在胞液中
关键词：
肌动蛋白 基因表达 包涵体
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
白俊杰 叶星 李新辉 简清 罗建仁
用逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)方法 ,从猪脑垂体总RNA中扩增出编码猪生长激素 (GH)成熟肽基因序列 ,定向克隆至质粒pUC18。序列分析表明 ,克隆的猪GHcDNA长 5 73bp ,不含信号肽序列 ,并在该序列之前加入一起始密码子ATG。将猪GHcDNA定向克隆至原核表达载体pBV2 2 0 ,构建成重组猪GH基因表达载体pBVpGH7。SDS PAGE和薄层扫描分析表明 :经 42℃诱导 ,pBVpGH7在大肠杆菌中可表达一分子量约 2 2 0 0 0的特异蛋白 ,表达量约占细胞总蛋白的 2 0 .5 %。
[期刊] 水产学报
[作者]
张为民 张勇 李欣 张利红 田静
通过构建斜带石斑鱼垂体cDNA文库,克隆了其生长激素(GH)全长cDNA。斜带石斑鱼GH全长cDNA为955bp,编码的多肽为204aa。应用PCR方法把编码GH成熟肽的cDNA片段克隆到表达载体pET-15b,在大肠杆菌BL21(DE3)表达N端含6个组氨酸的融合多肽。SDS-PAGE结果表明,0.4mmol·L-1IPTG诱导表达的蛋白约为24kDa,主要为不溶性的包含体。细菌裂解液沉淀溶于6mol·L-1盐酸胍后,用Ni2+-NTA树脂进行亲和分离纯化,纯化产物在SDS-PAGE上表现为一条24kDa的蛋白带。在黑鲷GH放射免疫分析系统中,纯化产物能与黑鲷GH竞争结合GH抗体,表明大肠杆...
关键词：
斜带石斑鱼 生长激素 克隆 表达
[期刊] 中国水产科学
[作者]
周勇 曾令兵 范玉顶 罗晓松 徐进 肖艺
根据GenBank中草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)VP6蛋白的全基因序列(AF403394)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的基因序列(M17874),设计并合成特异性引物,从感染草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾细胞(CIK)中提取病毒核酸作为模板,进行RT-PCR扩增,得到约1.3 kb的GCRV VP6基因读码框片段,同时提取大肠杆菌(Escherichia coli)H44815全基因组作为模板,进行PCR扩增得到约370 bp的LTB基因读码框片段。将获得的2个目的片段分别克隆到pCR2....
[期刊] 水产学报
[作者]
陈松林 M.Schartl
应用RT—PCR技术从白鲢垂体mRNA中扩增出GH全长cDNA片段 ,长度 1.2kb。将 1.2kb白鲢GHcDNA克隆到载体质粒pBluescriptKSII +(pBSKSII +)中 ,构建了pBS -scGHcDNA克隆 ;通过含有NdeI酶切位点的特异引物扩增出不含信号肽序列的cDNA片段 ,将其重组到pRSET5b载体质粒中 ,构建了白鲢GHcDNA表达质粒pRSET -scGH。将此表达质粒转化BL2 1(DE3)大肠杆菌 ,经IPTG诱导后 ,在转化的大肠杆菌中检测到GH蛋白的存在。Western印迹表明该蛋白带与草鱼GH单克隆抗体具有强烈的免疫反应。
关键词：
鲢 生长激素cDNA 表达载体 大肠杆菌
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