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[期刊] 中国水产科学
[作者]
冯海洋 邱高峰
从中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)和罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)卵巢cDNA中克隆了cyclin B基因的开放阅读框,分别连接到pGEX-2T和pET-32a表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白GST-EsCB和Trx-MrCB。通过优化培养温度、IPTG浓度以及诱导时间,得出重组蛋白的最佳表达条件分别为:0.1 mmol/L IPTG、37℃、4 h和0.1 mmol/L IPTG、30℃、6 h。重组蛋白主要以包涵体形式存在。亲和层析纯化重组蛋白,作为抗原免疫家兔,制备GST-EsCB和Trx-MrCB多克...
[期刊] 水产学报
[作者]
崔峥 朱小玲 邱高峰
Vasa基因具有在性腺中特异表达的特点,在生殖细胞分化与发育过程中起重要作用。从日本沼虾精巢cDNA中克隆了vasa基因的阅读框,连接到pET-32a载体,构建重组表达质粒pET32a-vasa,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导融合表达,表达产物经SDS-PAGE分析表明,融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约85ku,表达量约占包涵体总蛋白的48.7%,Western-blotting检测表明,融合蛋白可特异地被anti-HIS标签抗体识别。用Ni2+-NTA纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备获得多克隆抗体,ELISA显示该抗体效价达1∶160000,Western免疫鉴定显示该抗体不仅能识...
[期刊] 水产学报
[作者]
邱高峰 陈洁
Dmrt是性别调控因子Doublesex和Mab-3的相关基因,近年报道了中华绒螯蟹EsDmrt-like只在精巢中表达,为了验证EsDMRT-like蛋白是否在中华绒螯蟹精巢中特异表达及其功能,根据中华绒螯蟹EsDmrt-like基因序列,构建重组质粒pET-32a-EsDmrt-like,转化大肠杆菌BL21,经融合表达和SDS-PAGE分析表明,融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约为46ku。利用Ni柱亲和纯化融合蛋白免疫家兔,制备获得EsDMRT-like多克隆抗体。Western-blotting检测表明该抗体既能特异地识别重组蛋白,又能特异识别精巢中EsDMRT-like蛋白,并...
[期刊] 水产学报
[作者]
韩芳 王志勇 王晓清
食物过敏是人类常见的一种过敏性疾病,主要由食物中的蛋白质引起。原肌球蛋白(tropomyosin,TPM)是食用虾蟹等甲壳动物引起过敏反应的主要致敏物质。研究从日本囊对虾肌肉组织中克隆了TPM基因,进行了原核表达和蛋白质纯化,并进一步制备了相应的抗体。Western-blotting分析表明原肌球蛋白在日本囊对虾组织中普遍表达,并且肌肉组织中表达量最高而鳃和皮肤组织中表达量最低。研究结果为对虾过敏性疾病的诊断和治疗以及脱敏食品开发等奠定了理论基础。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
廖健淇 谢芝勋 张民秀 张艳芳 罗思思 李孟 谢志勤 谢丽基 邓显文 范晴 曾婷婷 黄娇玲 王盛
【目的】原核表达鸡细小病毒（ChPV）的NS1和VP2蛋白，制备其多克隆抗体，为深入探究ChPV蛋白结构功能及建立血清学诊断方法提供物质基础。【方法】通过合成ChPV GX-Ch-PV-21毒株的NS1和VP2蛋白基因序列，构建原核重组表达载体pET-32a-NS1和pET-32a-VP2，将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌transsetta感受态细胞进行原核表达，优化表达条件，以十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳和免疫印迹（Western-blotting）方法鉴定NS1和VP2蛋白的表达情况。将表达产物免疫无特定病原体（SPF）鸡获得多克隆抗体，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法测定其效价，以Western-blotting和间接免疫荧光试验(IFA)对多克隆抗体进行鉴定。【结果】SDS-PAGE分析结果显示，NS1和VP2蛋白条带大小分别约为104.0和87.0 kD，与预期条带大小相符。对重组质粒pET-32a-VP2和pET-32a-NS1进行最佳诱导条件筛选，结果显示NS1蛋白表达的最佳诱导条件为异丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）终浓度1.0 mmol/mL，16 ℃诱导表达过夜；VP2蛋白表达的最佳诱导条件为IPTG终浓度0.8 mmol/mL，20 ℃诱导表达过夜。可溶性分析结果显示，NS1和VP2蛋白主要以包涵体形式存在；间接ELISA检测NS1和VP2蛋白的多克隆抗体效价均为1︰10240000；Western-blotting鉴定结果表明，His标签蛋白和相对应的鸡多克隆抗体均能与NS1和VP2蛋白特异性结合；IFA分析结果显示，VP2和NS1蛋白多克隆抗体均能与ChPV特异性结合。【结论】成功表达ChPV的NS1和VP2蛋白和制备的鸡多克隆抗体，可作为深入探究ChPV蛋白结构功能及建立ChPV血清学诊断方法的基础材料。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
胡婧 程钢 谭艳平 王春台 刘学群
以常规基因重组技术,将orf216基因克隆入含有内含肽标签的原核表达载体pTYB1中,得到重组质粒pTYB1-orf216,经鉴定正确后,转化至大肠杆菌ER2566感受态细胞,15℃下0.8 mmol/LIPTG诱导15 h后,SDS-PAGE检测到大小约85 ku的特异性蛋白条带,融合蛋白以可溶组分形式存在。融合蛋白经亲和纯化后制备多克隆抗体,Western blot分析表明多克隆抗体具有较高的特异性,可与免疫原特异结合。
关键词：
水稻 原核表达 亲和纯化 抗体
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
王树云 陈孝煊 王敏 周金敏 于艳梅 岳刚毅 李莉娟
为获得斑点叉尾鮰疱疹病毒ORF6和ORF10基因,设计特异性引物进行PCR扩增,成功构建pET-32a-ORF6和pET-32a-ORF10原核表达载体,经IPTG诱导后目的蛋白在大肠杆菌中成功表达并制备多抗,通过Western blot证明ORF10的抗体具有特异性,且ORF10为病毒的结构蛋白。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王娟 王桂萍 张红生 夏妍 沈振国
为研究耐铜植物海州香薷的金属硫蛋白(EhMT1)的结构与功能,运用分子生物学方法构建了pGEX-2T-EhMT1重组表达载体,经转化大肠杆菌BL21(DE3)后表达得到大小为33×103左右的融合蛋白GST-EhMT1,与预期结果一致。对融合蛋白诱导表达的温度、时间、IPTG诱导浓度等条件进行了优化,成功构建了能大量表达可溶性GST-EhMT1的优良原核表达体系。诱导表达的融合蛋白经GST-Sepharose亲和层析纯化后,每升菌液获得的可溶性融合蛋白高达70mg。用纯化的融合蛋白免疫新西兰雄兔,制备的抗血清经间接ELISA检测到较高的多克隆抗体效价。蛋白质印迹结果显示,纯化的蛋白质与兔抗血清...
关键词：
金属硫蛋白 原核表达 融合蛋白 抗血清
[期刊] 水产学报
[作者]
杜晓琳 王兰 孙敏
为了研究生殖调控分子VASA在河南华溪蟹性腺发育过程中的表达模式和功能,本研究制备了VASA蛋白特异的多克隆抗体。选取河南华溪蟹vasa基因813 bp的特异区段,克隆到p ET32a载体,构建了原核表达载体p ET32a-Shvasa,转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达和SDS-PAGE检测。结果显示,47 ku的VASA融合蛋白在菌液上清液中大量存在。VASA融合蛋白经Ni-NTA His-Bind亲和层析柱分离纯化后,免疫新西兰大白兔,制备了河南华溪蟹VASA蛋白的多克隆抗体。ELISA检测显示,VASA蛋白多克隆抗体的效价高达1.0×105。进一步通过免疫吸附实验和Western blot方法鉴定抗体特异性,研究表明,获得的多克隆抗体不仅能识别VASA融合蛋白,而且能特异识别河南华溪蟹卵巢中的天然VASA蛋白。研究为鉴定河南华溪蟹及其他蟹类生殖细胞提供了有效手段,为进一步解析十足目动物VASA蛋白的功能提供了分子基础。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
褚文辉 张伟 赵海平 王大涛 李春义
为研究梅花鹿Thymosin beta 10基因(Tβ10)在鹿茸快速生长过程中的作用,利用Gateway技术构建梅花鹿Tβ10基因的原核表达载体—pDEST17-Tβ10并诱导表达,对融合蛋白进行功能检测及多克隆抗体制备。结果表明:1)获得了190bp Tβ10基因开放阅读框序列,并获得重组表达载体pDEST17-Tβ10。2)pDEST17-Tβ10在宿主BL21-SI中诱导表达条件为0.3mol/L NaCL诱导2h,获得产物的最终浓度为0.50mg/mL。3)制备的Tβ10蛋白多克隆抗体血清效价在105之上,该抗体可以特异性结合天然和原核表达的Tβ10蛋白。4)离体检测发现,Tβ10融合蛋白一方面可以促进人脐静脉内皮细胞增殖,另一方面可以抑制鹿茸前成软骨区细胞的增殖。综上所述,本研究获得了具有生物活性的Tβ10融合蛋白,并制备了高度特异性的梅花鹿Tβ10蛋白多克隆抗体,为深入研究Tβ10基因的生物学功能奠定了基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张帅磊 赵天永
[目的]制备玉米三磷酸甘油醛(GAPDH)和肌动球蛋白(ACTIN)的多克隆抗体,检测热激条件下玉米B73叶片中ZmGAPDH和ZmACTIN的表达,为将ZmGAPDH和ZmACTIN作为非生物胁迫下的内参基因奠定基础。[方法]利用DNAMAN 7对ZmGAPDH和ZmACTIN与不同植物同源蛋白间的氨基酸序列进行比对。通过PCR克隆ZmGAPDH和ZmACTIN的CDS,将其构建到原核表达载体pET-28a中并测序;将重组质粒载体转化大肠杆菌BL21(DE3)和RG2,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达;将目的蛋白透析纯化后免疫家兔制备多克隆抗体。利用RT-PCR和Western blot检测42℃热激不同时间(0,2,4,8 h)下玉米B73叶片中ZmGAPDH和ZmACTIN mRNA及其蛋白的表达水平。[结果]克隆了ZmGAPDH和ZmACTIN基因的CDS序列,成功构建了原核表达载体pET-28a-ZmGAPDH和pET-28a-ZmACTIN。在大肠杆菌中表达出了玉米ZmGAPDH和ZmACTIN蛋白,将纯化的蛋白免疫家兔后获得了多抗血清。ZmGAPDH多克隆抗体能清晰检测到4 ng原核表达的ZmGAPDH抗原,ZmACTIN多克隆抗体同样能够清晰检测到4 ng原核表达的ZmACTIN抗原。热激不同时间下玉米B73叶片中的ZmGAPDH和ZmACTIN蛋白表达水平一致,mRNA丰度稳定不变。[结论]成功制备了ZmGAPDH和ZmACTIN蛋白多克隆抗体;ZmGAPDH和ZmACTIN可以作为内参基因,用于检测热激条件下目标基因的表达水平。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张帅磊 赵天永
[目的]制备玉米三磷酸甘油醛(GAPDH)和肌动球蛋白(ACTIN)的多克隆抗体,检测热激条件下玉米B73叶片中ZmGAPDH和ZmACTIN的表达,为将ZmGAPDH和ZmACTIN作为非生物胁迫下的内参基因奠定基础。[方法]利用DNAMAN 7对ZmGAPDH和ZmACTIN与不同植物同源蛋白间的氨基酸序列进行比对。通过PCR克隆ZmGAPDH和ZmACTIN的CDS,将其构建到原核表达载体pET-28a中并测序;将重组质粒载体转化大肠杆菌BL21(DE3)和RG2,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达;将目的蛋白透析纯化后免疫家兔制备多克隆抗体。利用RT-PCR和Western blot检测42℃热激不同时间(0,2,4,8 h)下玉米B73叶片中ZmGAPDH和ZmACTIN mRNA及其蛋白的表达水平。[结果]克隆了ZmGAPDH和ZmACTIN基因的CDS序列,成功构建了原核表达载体pET-28a-ZmGAPDH和pET-28a-ZmACTIN。在大肠杆菌中表达出了玉米ZmGAPDH和ZmACTIN蛋白,将纯化的蛋白免疫家兔后获得了多抗血清。ZmGAPDH多克隆抗体能清晰检测到4 ng原核表达的ZmGAPDH抗原,ZmACTIN多克隆抗体同样能够清晰检测到4 ng原核表达的ZmACTIN抗原。热激不同时间下玉米B73叶片中的ZmGAPDH和ZmACTIN蛋白表达水平一致,mRNA丰度稳定不变。[结论]成功制备了ZmGAPDH和ZmACTIN蛋白多克隆抗体;ZmGAPDH和ZmACTIN可以作为内参基因,用于检测热激条件下目标基因的表达水平。
[期刊] 华北农学报
[作者]
王芳 汤璧蔚 董乐 刘宝 黄慧 黄苹苹 张立群 栾芙蓉
为探讨蓖麻肌动蛋白(Actin)基因(RcActin)是否可作为蓖麻基因表达研究中的内参基因。以蓖麻生长根为试验材料,根据GenBank中公布的RcActin全长cDNA序列(登录号:XM_002522148.3)设计合成特异性引物,经PCR扩增获得RcActin的编码序列(CDS),并将其插入原核表达载体pET32a(+)中。重组表达载体pET32a(+)-RcActin转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合6个组氨酸标签的目的蛋白,表达蛋白经钴离子螯合磁珠纯化后,采用Western Blot验证,结果表明,pET32a(+)-RcActin可诱导表达分子量约为61.46 ku的融合蛋白His-RcActin。用纯化的His-RcActin免疫BALB/c小鼠,经细胞融合及筛选获得9株能分泌抗蓖麻RcActin蛋白质单克隆抗体(Monoclonal antibody, McAb)的杂交瘤细胞株。利用阳性杂交瘤细胞株刺激小鼠,取腹水,采用间接ELISA方法测定,结果表明,5株阳性单克隆细胞株腹水效价达到1∶1 000 000及以上。用蛋白A/G亲和层析法纯化His-RcActin McAb;采用间接ELISA方法对纯化McAb的特异性进行测定,3株阳性细胞株能分泌针对RcActin的特异性McAb;通过抗体亚类鉴定试剂盒鉴定纯化McAb的亚型,结果表明,3株阳性细胞株分泌的McAb亚类均为IgG1。采用间接ELISA方法对3株阳性细胞株分泌McAb的稳定性进行鉴定,获得1株在体外传19代或液氮冻存4个月后、能稳定分泌McAb的阳性细胞株。采用Western Blot和间接ELISA方法对从该细胞株中纯化的McAb的特异性、效价进行验证,结果表明,获得的McAb具有针对RcActin的特异性且效价为1∶512 000。以制备的McAb为一抗,利用Western Blot方法分析RcActin在正常水肥管理且时空一致条件下的蓖麻8个组织中的表达量,结果表明,蓖麻不同组织中RcActin的含量存在显著性差异(P<0.05)。RcActin表达研究为蓖麻功能基因表达分析中内参基因的筛选提供了一定的理论依据。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
孙盛明 戈贤平 傅洪拓 朱健 张世勇 乔慧
应用RACE技术克隆了青虾(Macrobrachium nipponense)的Hc基因全长cDNA序列,并对该基因序列特征进行了分析。青虾Hc基因cDNA全长2 235 bp,包括10 bp的5′末端非翻译区(UTR),2 074 bp的开放阅读框(ORF),151 bp的3′UTR,开放阅读框编码688个氨基酸。蛋白相似度比对显示,青虾血蓝蛋白含有典型的6个保守的铜离子结合位点。系统进化树分析表明,青虾Hc与脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)Hc聚在一起,具有最近的亲缘关系。荧光定量PCR检测显示,Hc基因在青虾不同组织中均有表达,其表达量在肝胰腺中最高;使用荧光定...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
上官晓庆 张春霞 赵天永
[目的]将玉米异分支酸合成酶1(ZmICS1)及系统获得抗性缺陷1(ZmSARD1)进行原核表达和纯化,并免疫家兔获得多克隆抗体,为深入研究ZmICS1和ZmSARD1在玉米抵抗病原菌胁迫中的功能奠定基础。[方法]克隆玉米ZmICS1和Zm SARD1基因CDS区,连接到原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌表达菌株Rosettgami2(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达His_(×6)-ZmICS1和His_(×6)-ZmSARD1重组蛋白,以透析纯化后的重组蛋白为抗原免疫家兔,制备多克隆抗体,并进行验证和检测。[结果]成功构建了原核表达载体pET-28aZmICS1和pET-28a-ZmSARD1,于37℃、0.84 mmol/L IPTG在大肠杆菌表达菌株Rosett-gami2(DE3)中诱导出His_(×6)-ZmICS1和His×6-ZmSARD1重组蛋白。纯化蛋白免疫家兔,所得ZmICS1抗体能够检测到3 ng的His_(×6)-ZmICS1,ZmSARD1抗体能检测到低至0.3 ng的His_(×6)-ZmSARD,且分别能特异性地检测玉米B73原生质体过表达的ZmICS1和ZmSARD1蛋白。[结论]成功制备了玉米ZmICS1、ZmSARD1多克隆抗体,可用于玉米内源ZmICS1和ZmSARD1蛋白含量的检测。
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