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[期刊] 华北农学报
[作者]
颜新敏 张强 吴国华 李健 朱海霞
为探讨鉴别山羊痘病毒和绵羊痘病毒的分子生物学方法,对实验室分离保存的3株山羊痘病毒和2株绵羊痘病毒进行p32基因和GpCR基因扩增、克隆及序列分析。将获得的p32基因序列与GenBank上登陆的羊痘病毒p32基因进行HinfⅠ酶切位点分析表明,所有绵羊痘病毒p32基因在391 bp和691 bp处存在2处酶切位点,而山羊痘病毒仅在688 bp处存在1个酶切位点。将获得的GpCR基因序列与GenBank上登录的31条相应序列进行系统进化树分析发现,根据GpCR基因序列信息可将绵羊痘病毒和山羊痘病毒分成两个独立的进化分枝。这些结果表明,利用p32基因的HinfⅠ酶切位点信息和对GpCR基因进行分子...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
陈轶霞 王明明 龙玲 邵忠伟 刘俊林
通过计算机软件筛选出绵羊痘病毒基因组中心编码区的ORF90核蛋白、ORF112融合蛋白、ORF117糖蛋白、ORF55膜蛋白和基因组末端的ORF134宿主范围相关基因的6段T、B细胞优势抗原表位,以柔性氨基酸(GPGPG)作为接头，串联合成1条全新的多表位嵌合基因mE，将其克隆到原核表达载体pET-32中，采用酶切分析与序列测定方法筛选鉴定阳性重组质粒，构建pET32-mE质粒；用IPTG在不同条件下诱导表达，确定最佳表达条件，表达产物经SDS-PAGE分析。结果表明，重组蛋白是分子质量为41 ku的融合蛋白。在IPTG浓度为0.5 mmol/L，温度为37℃、诱导4 h时目的蛋白的表达量最...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
陈轶霞 王明明 龙玲 邵忠伟 刘俊林
通过计算机软件筛选出绵羊痘病毒基因组中心编码区的ORF90核蛋白、ORF112融合蛋白、ORF117糖蛋白、ORF55膜蛋白和基因组末端的ORF134宿主范围相关基因的6段T、B细胞优势抗原表位,以柔性氨基酸(GPGPG)作为接头,串联合成1条全新的多表位嵌合基因mE,将其克隆到原核表达载体pET-32中,采用酶切分析与序列测定方法筛选鉴定阳性重组质粒,构建pET32-mE质粒;用IPTG在不同条件下诱导表达,确定最佳表达条件,表达产物经SDS-PAGE分析。结果表明,重组蛋白是分子质量为41ku的融合蛋白。在IPTG浓度为0.5mmol/L,温度为37℃、诱导4h时目的蛋白的表达量最大,约占...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
杨柳 许国洋 牟豪 白运川 余远迪
以提取羊口疮痂皮中病毒的DNA为模板，用PCR扩增羊口疮病毒(ORFV)的059基因序列，并进行基因克隆、测序鉴定和生物信息学分析；优化合成059基因编码序列，连接载体pET42a(+)，转化Escherichiacoli BL21(DE3)；用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导阳性克隆菌，采用免疫印迹检测表达的F1L蛋白，并以His柱纯化蛋白、梯度法复性及Bradford法测定蛋白浓度；将BHK21细胞铺于12孔板中培养至单层，分别作F1L蛋白、山羊痘病毒(GTPV)、先蛋白后病毒、蛋白和病毒混液4种方式孵育，利用荧光定量PCR测定孵育至1.0、6.0h的细胞黏附GTPV的量，研究ORFV F1L蛋白对GTPV黏附BHK21细胞的影响。结果表明：成功获得了ORFV重庆石柱分离株(ORFV–CQsz)的059基因编码序列，其编码的F1L蛋白包含1个结合细胞表面硫酸乙酰肝素受体的结构域，显示出肝素结合活性；该蛋白羧基端有2个跨膜区，不利于蛋白质的表达，但优化DNA序列构建的重组质粒菌，经IPTG诱导后获得对F1L蛋白的高效表达；免疫印迹显示F1L蛋白对ORFV抗体有较好的反应原性；Bradford法测定的纯化复性的F1L蛋白质量浓度为1.06mg/m L；荧光定量PCR检测数据显示，不同孵育处理下GTPV黏附细胞的拷贝数不同，表明F1L蛋白对GTPV黏附BHK21细胞呈现一定的干扰作用，能降低病毒黏附到细胞的拷贝数。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
杨柳 许国洋 牟豪 白运川 余远迪
以提取羊口疮痂皮中病毒的DNA为模板，用PCR扩增羊口疮病毒(ORFV)的059基因序列，并进行基因克隆、测序鉴定和生物信息学分析；优化合成059基因编码序列，连接载体pET42a(+)，转化Escherichiacoli BL21(DE3)；用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导阳性克隆菌，采用免疫印迹检测表达的F1L蛋白，并以His柱纯化蛋白、梯度法复性及Bradford法测定蛋白浓度；将BHK21细胞铺于12孔板中培养至单层，分别作F1L蛋白、山羊痘病毒(GTPV)、先蛋白后病毒、蛋白和病毒混液4种方式孵育，利用荧光定量PCR测定孵育至1.0、6.0h的细胞黏附GTPV的量，研究ORFV F1L蛋白对GTPV黏附BHK21细胞的影响。结果表明：成功获得了ORFV重庆石柱分离株(ORFV–CQsz)的059基因编码序列，其编码的F1L蛋白包含1个结合细胞表面硫酸乙酰肝素受体的结构域，显示出肝素结合活性；该蛋白羧基端有2个跨膜区，不利于蛋白质的表达，但优化DNA序列构建的重组质粒菌，经IPTG诱导后获得对F1L蛋白的高效表达；免疫印迹显示F1L蛋白对ORFV抗体有较好的反应原性；Bradford法测定的纯化复性的F1L蛋白质量浓度为1.06mg/m L；荧光定量PCR检测数据显示，不同孵育处理下GTPV黏附细胞的拷贝数不同，表明F1L蛋白对GTPV黏附BHK21细胞呈现一定的干扰作用，能降低病毒黏附到细胞的拷贝数。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
余远迪 牟豪 张阳 郑华 李幸 付利芝
【目的】采用Cre/Loxp基因编辑系统，在羊痘病毒135基因位点插入ORFV外源基因F1L，同时引入标记基因，从而构建重组山羊痘病毒，为临床上预防羊口疮疫苗的设计、研制提供参考。【方法】以pDonor载体为基础，135基因编码区两侧500 bp左右的片段作为上下重组同源臂，中间插入羊口疮病毒F1L基因编码区及标记基因gpt、EGFP、痘病毒早晚期启动子p7.5、p11，并且含有loxp位点，构建同源重组供体质粒命名为pGTPV(135)-ORFV-F1L；并对阳性克隆菌液进行PCR鉴定并测序，经测序正确的菌液接种氨苄LB液体培养基培养过夜，提取去内毒素的质粒并进行双酶切鉴定。山羊痘病毒弱毒株感染永生化山羊睾丸细胞2 h后，重组质粒经脂质体法转染永生化山羊睾丸细胞，观察细胞病变及EGFP标记基因的表达情况；48 h后收获病毒液，反复冻融后离心，盲传3代，通过PCR鉴定目标基因的整合情况，以羊口疮病毒阳性血清为一抗，驴抗山羊IgG为二抗，通过蛋白免疫印迹分析目标基因的表达情况来对获得的重组病毒进行鉴定。【结果】经PCR筛选，成功获得表达羊口疮病毒F1L基因的同源重组供体质粒。经过测序并与目标序列进行比对，结果正确，表明重组质粒成功构建。重组质粒经去内毒素提取后测定浓度并进行双酶切鉴定，结果与预期相符，经鉴定的重组质粒转染山羊睾丸细胞，在48 h后观察到细胞病变及绿色荧光，PCR鉴定结果表明F1L基因整合到重组病毒上。蛋白免疫印迹分析显示，检测到目标蛋白条带，说明重组山羊痘病毒插入的外源基因F1L基因成功表达。【结论】本研究成功地构建了一种在135基因位点表达羊口疮病毒F1L基因的重组山羊痘病毒，并在永生化山羊睾丸细胞中，该重组病毒展现出目的基因的稳定表达。以羊痘病毒弱毒株135基因位点插入羊口疮病毒F1L外源基因，该重组病毒在永生化山羊睾丸细胞中获得，目的基因能稳定表达，成功建立构建135基因位点插入羊口疮病毒F1L基因的重组山羊痘病毒方法。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张冬峰 郑亚东 骆学农 王晓霞 陈轶霞 李辉 侯俊玲 潘晓梅 刘琼 景志忠 岳城 才学鹏
从甘肃景泰疑似羊痘患病绵羊的皮肤组织中提取基因组DNA,利用PCR技术,克隆糖蛋白orf118基因.比较分析表明,该基因由516个核苷酸组成,编码171个氨基酸,相对分子质量为19500,其碱基组成极不平衡,其中A+T含量占72.48%,G+C含量仅占27.52%.甘肃景泰株orf118基因同绵羊痘病毒TU-V02127株之间的核苷酸同源性最高达99.8%,氨基酸的同源性为100%;与疙瘩皮肤病病毒肯尼亚株和山羊痘病毒G20-LKV株之间的同源性分别为96.5%和94.8%.结构预测结果显示,orf118蛋白为分泌蛋白,具有2个N键连结糖基化位点和1个跨膜区.以上结果表明,orf118蛋白在不...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
张冬峰 郑亚东 骆学农 王晓霞 陈轶霞 李辉 侯俊玲 景志忠 才学鹏
从甘肃景泰县疑似患羊痘的绵羊皮肤组织中提取基因组DNA,PCR扩增膜蛋白ORF23基因.序列分析表明,该基因由1113个核苷酸组成,编码370个氨基酸,A+T含量占69.90%,G+C含量仅占30.10%.绵羊痘病毒甘肃株ORF23基因与A株、NISKHI株之间的核苷酸同源性分别为99.6%和99.5%,氨基酸同源性分别为98.7%和98.4%;与皮肤疙瘩病病毒NW-LW株和山羊痘病毒Pellor株之间的核苷酸同源性均为98.2%.结构预测显示,ORF23膜蛋白为非分泌蛋白,具有一个O连结糖基化位点.可见,ORF23膜蛋白在不同的绵羊痘病毒流行株之间非常保守,具有潜在的疫苗和诊断研究价值.
关键词：
绵羊痘病毒 ORF23 膜蛋白
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
朱娜 陈国强 张敬友 范红结
根据GenBank发表的猴痘病毒(AF380138)F3L基因全序列,设计并合成了引物和TaqMan、MGB探针,建立了F3L基因的荧光定量PCR检测方法。应用该方法可从人工合成的猴痘病毒F3L基因片段(48 048～48 509 bp)扩增典型的"S"型曲线,25μL反应体系检测灵敏度可达6.8拷贝,但不能从鸡痘、山羊痘等病毒中扩增出相应的扩增曲线。结论:本方法可快速、敏感、特异地检测猴痘病毒。
关键词：
猴痘病毒 荧光定量PCR 检测
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
丁巧玲 陈溥言
将马立克氏病病毒 (MDV)gB基因插入鸡痘病毒 (FPV)中 ,构建了含有MDVgB基因的重组鸡痘病毒 (rFPV)。用rFPV、HVT冻干苗、rFPV +HVT疫苗分别免疫 1日龄AA肉用雏鸡 ,于 8日龄攻毒后观察疫苗免疫效果。实验结果表明 ,HVT、rFPV、HVT +rFPV疫苗免疫组比攻毒对照组病毒血症持续时间短 ;上述 3种疫苗免疫后用京 1株MDV(vMDV)攻毒 ,脾脏T淋巴细胞增殖反应处于较高水平 ,而攻毒对照组脾脏T淋巴细胞增殖反应减弱 ,两者差异显著(P
[期刊] 西南农业学报
[作者]
龚国淑 冷怀琼 张咏梅 谢桂蓉
当年生早酥梨幼苗接种茎痘病毒（ＳＰＶ）后，定期测定其叶片的核酸、蛋白质、可溶性糖、叶绿素和矿质元素等含量。结果表明，病株中ＰＮＡ、蛋白质、可溶性糖含量在接种ＳＰＶ前期增加，后期降低；与健株相比，病株ＤＮＡ、Ｆｅ、Ｃｕ增加，叶绿素、Ｐ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｏ、Ｂ等矿质元素的含量降低。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
程国富 李红文 周诗其 谷长勤 胡薛英
对湖北省某地发生的以高热、皮肤出现丘疹、消瘦、母羊流产、羔羊死亡率高为特征的疾病 ,进行了病例调查、临床症状、大体剖检以及病理组织学检查。结果表明在感染山羊的皮肤上皮细胞、气管粘膜上皮细胞中发现有嗜酸性病毒包涵体存在。其他脏器均有不同程度的病变。根据临床症状、流行病学特点以及病理变化确诊该病为山羊痘 ,并讨论了该疾病的可能发病机制
关键词：
山羊痘 病理变化 包涵体 诊断
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
黄哲 潘雪义 袁哲明 胡松奇
采用时间—剂量—死亡率模型,分析了粘虫痘病毒(PsEPV)重组增效蛋白P39对棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)感染棉铃虫幼虫的增效作用.结果显示:初步纯化的P39对HaNPV感染棉铃虫3龄幼虫显示了极显著的增效活性,感染后11 d,HaNPV+P39组的LC50(1 082 PIBs/mL)比HaNPV组(13 831 PIBs/mL)降低了92.18%,增效倍数达12.8;HaNPV为1.6×103～1.6×106 PIBs/mL时,P39可缩短LT50 0.5～2.7 d.
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
文征宇 侯文韬 杨龙雨 陈鹏
【目的】建立牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ(Vaccinia topoisomeraseⅠ)的原核表达体系及纯化方法,以获得高活性、高纯度的牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ。【方法】优化并人工合成牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ的全基因序列,构建牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ的原核表达载体(pET28a/TOPO)并转化E.coliBL21 Star(DE3)菌株,优化其诱导表达条件,表达蛋白经Talon his-tag purification resin螯合层析柱纯化,用SDS-PAGE鉴定纯化效果,借助酶切质粒pLLP-OmpA检测纯化蛋白的活性。【结果】转化pET28a/TOPO的E.coliBL21 Star(DE3)特异地表...
关键词：
牛痘病毒拓扑异构酶Ⅰ 原核表达 蛋白纯化
[期刊] 华北农学报
[作者]
张俊环 孙浩元 Boris Krska 杨丽 姜凤超 张美玲 王玉柱
为快速检测引进杏资源是否携带李痘病毒(PPV),并从国内资源中筛选抗PPV材料,通过RT-PCR和荧光定量PCR 2种方法的比较验证,确定了RT-PCR为快速、准确、经济高效检测杏PPV病毒病的方法,并明确了PCR扩增体系和反应条件的具体参数。扩增体系为20μL,包括10×Buffer 2μL、25 mmol/L Mg~(2+)1. 6μL、10 mmol/L d NTP0. 4μL、0. 5 U/μL Taq酶0. 2μL、上下游引物各0. 4μL、模板c DNA 1μL、dd H_2O 14μL。RT-PCR反应条件:94℃预变性5 min,然后以94℃变性45 s、55℃退火30 s、72℃延伸45 s,进行35个循环,72℃延伸10 min。利用捷克孟德尔大学园艺学院构建的杏PPV抗性分离F1群体,采用SSR分子标记技术和集团分离分析法(BSA)相结合的策略,首先在抗PPV和易感PPV的对等基因间进行多态性标记的筛选,初步筛选得到6个SSR位点(PGS1. 23、PGS1. 24、Pa CITA5、UDAP-414、Pchcms4和Pchgms4)在两亲本间和2个对等基因池间的多态性是一致的,并进一步在F1分离群体间进行复选和验证,最终筛选到1个与PPV抗性性状连锁程度较高的SSR分子标记PGS1. 23,此标记检测杏资源分离群体PPV抗性的符合度达到了78. 3%。进而利用该标记在37份我国杏种质中进行了PPV抗性评价,结果筛选出了5份抗PPV的杏资源,分别是菜籽黄、杨继元、垂枝山杏、大早熟和媳妇杏,为今后杏的抗PPV育种提供较好的亲本材料,也为进一步挖掘抗PPV基因的深度研究奠定了基础。
关键词：
李痘病毒 杏 分子检测 SSR BSA
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