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[期刊] 华北农学报
[作者]
严蕾艳 张宴瑜 马凯慧 宋慧 王毓洪
为了更快更准确地在病菌潜伏期或发病初期鉴定出尖孢镰刀菌引起的瓜类枯萎病和茄病镰刀菌引起的瓜类根腐病这2种病害,根据尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的翻译延长因子TEF1-α序列设计了3条种特异性引物。引物对FO-F和Fu-R可以从尖孢镰刀菌中扩增到1条228 bp的片段,引物对FS-F和Fu-R可以从茄病镰刀菌中扩增到1条347 bp片段,并且3条引物FO-F、FS-F和Fu-R可以同时在1个PCR反应中扩增到2个片段,而这2对引物都不能从其他病原真菌中扩增到任何条带。结果表明,该多重PCR检测方法可以同时鉴定样品中的2种镰刀菌。
[期刊] 华北农学报
[作者]
李欣 崔秀明 刘迪秋 孙恬 郭爱玲 陈军
为了建立一种准确、快速检测三七根腐病病原真菌尖孢镰刀菌的实时荧光定量PCR方法,基于尖孢镰刀菌脂肪酸ω-羟化酶基因设计了实时荧光定量PCR的特异性引物对Fo-QF和Fo-QR,制备了该基因的重组质粒标准品,建立了尖孢镰刀菌的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。从三七种植区采集到14个具有根腐病、黑斑病典型症状的三七病株及三七种植土壤样品,并提取了这些样品的总DNA,运用本研究建立的荧光定量PCR方法进行了检测。结果显示,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法特异性强,脂肪酸ω-羟化酶基因只以尖孢镰刀菌DNA为模板扩增出特异的PCR产物。此外,该方法灵敏度高,检测模板浓度可低至0. 35 pg/μL。构建的荧光定量PCR标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线的吸收峰单一,扩增效率好。利用该定量检测体系,能从几种不同的三七病株中快速检测出携带尖孢镰刀菌的根腐病病株,从而达到准确诊断的目的。本方法不仅能明确三七种植土壤以及三七病株中尖孢镰刀菌数量的动态变化,并且可以为三七土壤处理、根腐病的早期诊断和动态监测以及带病三七种子、种苗的快速分子检测提供技术支持。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
蒋荷 郑慧慧 曹莎 吴学宏 黄俊生
为检测黄瓜种传镰刀菌产生的粗毒素中镰刀菌酸含量及其对种子和幼苗的致害作用,采用乙酸乙酯和乙醚萃取法提取其中的镰刀菌酸并利用HPLC法进行定量分析,通过粗毒素处理黄瓜种子及幼苗根部测定其对种子发芽的影响和幼苗的致枯萎作用。结果表明:供试7株种传镰刀菌SC-CQ-P、HLJ-XC-S、LN-ZN203-S、GD-HY-S、HN-XH-S、LN-ZN6-S和HB-TS-R粗毒素中都检测到镰刀菌酸,质量浓度分别为3 574.71、866.43、291.10、123.32、856.13、358.27和327.71μg/mL。种传镰刀菌粗毒素对黄瓜种子发芽具有一定的抑制作用;粗毒素浸渍黄瓜幼苗根部导致幼苗...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
董文盼 杨纪潇 杨项明 吕明慧 朱彦泽 蒋春号
[目的]本文构建了西瓜枯萎病菌—尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveum，FON）的重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification， RPA）的快速检测体系，以期为田间西瓜枯萎病的快速检测提供技术支持。[方法]从NCBI网站下载包括西瓜枯萎病菌在内的11种病原真菌的基因组序列，利用SeqHunter2软件进行生物信息学分析，经比对得到4个FON的特异性基因片段，并对其进行引物设计和筛选。利用聚合酶链式反应（PCR）验证引物的特异性和灵敏度，而后利用建立的RPA检测体系对引物的特异性和灵敏度进行验证，最后进行人工接种FON的西瓜植株的RPA检测与评价。[结果]本文首次报道了FON的RPA检测体系，并对DNA恒温快速扩增试剂盒的扩增体系进行最佳反应时间（40 min）和最适反应温度（30℃）的摸索，得到其最佳反应体系的检测下限为100 pg/μL。利用DNA恒温快速扩增试剂盒（胶体金试纸条型）进行扩增时，只需在38℃反应12 min，取50 μL稀释20倍的扩增产物用胶体金试纸条进行检测，5 min后即可进行结果的判断，检测下限为100 pg/μL。[结论]本文通过多种检测方法对RPA扩增结果进行检测，均得到一致的结果，且建立的RPA检测体系能够从温室接种FON之后未显症的西瓜植物组织基因组DNA中检测到FON，可为田间西瓜枯萎病早期的快速检测提供技术支持。
[期刊] 草业科学
[作者]
朱倩丽 赵官涛 王露 何翔 张洋洋 王常清 聂江山 陈秀蓉
禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是真菌性玉米茎基腐病的主要致病菌之一,为了减少种子带菌对该病害的传播,本研究采用巢式PCR技术构建玉米种子检测体系,并对其进行特异性、灵敏度和可行性检测。结果表明,该体系可有效检测到玉米(Zea mays)种子携带禾谷镰刀菌的情况,灵敏度达4.224 pg·μL-1,是一种快速、灵敏、特异性强的检测体系,为玉米茎基腐病种子带菌检测、早期诊断和及时防治提供技术支持和理论依据。本研究是运用巢式PCR技术检测玉米茎基腐病主要致病菌-禾谷镰刀菌在国内的首次报道。
[期刊] 海洋水产研究
[作者]
许拉 黄健 戈蕾 杨冰
通过检索、多重比对、分析和筛选GenBank中对虾白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、副溶血弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌的基因序列,设计了10对特异性引物,以已知毒株和菌株的DNA为模板进行PCR,均能扩增出与实验设计相符合的DNA片段,对PCR扩增条件进行优化,建立了可同时检测鉴别WSSV、IHHNV、副溶血弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌,并且能同时区分WSSV不同地理毒株的同步PCR方法。研究结果表明,该方法检测特异性好,检测通量大,适合于对虾多种病原的同时检测。
关键词：
对虾 PCR 检测 病毒 弧菌
[期刊] 中国农业科学
[作者]
柴阿丽 韩云 武军 石延霞 谢学文 李宝聚
【目的】茄病镰刀菌(Fusarium solani)孢子活性的检测是病害有效防控的基础。传统的孢子萌发法操作复杂,耗时费力,需要建立一种简便、快速的孢子活性检测方法。研究旨在建立基于荧光素二乙酸酯(fluorescein diacetate,FDA)-碘化丙啶(propidium iodide,PI)双荧光复染法和流式细胞术(flow cytometry,FCM)的茄病镰刀菌孢子活性检测技术。【方法】通过测定FDA和PI的最佳染色时间和最佳工作浓度,建立茄病镰刀菌孢子活性检测的FDA-PI复染法。为评价该方法的准确性,一方面用FDA-PI法检测已知死孢子比例(0、25%、50%、75%、100...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李启新 杜琦 陈长法 李祥
以棉枯萎镰刀菌公安菌株为材料,用物理法和化学法提取抗原并制备抗血清,并选有代表性的抗血清对其特异性和灵敏度分别采用4种检测方法进行了检测比较研究。结果表明:(1)采用 Richard’s培养基振荡培养菌株,化学法提取菌丝孢子抗原,按改进的 J.E.Devay 设计的免疫方案免疫,能产生效价高达1:64的抗血清。(2)琼扩、比较对流免疫电泳、间接 ELISA,SPA-ELISA 等4种方法检测其特异性具有鉴别到尖孢镰刀菌种的水平的特异性,但不能鉴别专化型和生理小种。并用上述方法检测抗血清灵敏度。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
李晨 王秀华 黄倢
根据目前水产上常见病原菌鳗弧菌Vibrio anguillarum、嗜水气单胞菌Aeromonas hy-drophila、迟缓爱德华氏菌Edwardsiellatarda的毒力相关基因,选择具有特异性的鳗弧菌调控毒力蛋白表达的toxR(Positive transcriptional regulator)基因、嗜水气单胞菌中重要的编码气溶素(Aero-lysin)基因aerA、迟缓爱德华氏菌中编码分泌系统装置蛋白的基因evpA,分别设计1对特异性引物,建立可同时特异性地检测3种菌的多重PCR检测体系。对反应条件进行优化并测试了其特异性和灵敏度。实际样品检测证明,此多重PCR体系具有良好的可靠...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
魏霜 冼钰茵 赵晖 吴希阳
【目的】建立在扩增内标存在下同时快速检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌4种食源性致病菌的五重PCR方法。【方法】以细菌16S rRNA基因为扩增内标靶序列,针对溶藻弧菌gyrB基因、副溶血弧菌collagenase基因、创伤弧菌vvhA基因、霍乱弧菌ompW基因,分别设计特异性引物,建立多重PCR体系,对其灵敏度和特异性进行评价,并将建立的五重PCR应用于弧菌的筛选。【结果】建立的多重PCR检测体系对混合模板中副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌的灵敏度达10 CFU/mL,霍乱弧菌的灵敏度达105CFU/mL,经特异性评价证实其特异性好,并能有效指示PCR反应的假阴性,将建立的多重PCR...
关键词：
弧菌 检测 多重PCR
[期刊] 林业科学研究
[作者]
陈帅康 王彩霞 施万斌 鲁海龙 董安昊 刘楚丽 马荣
[目的]探讨嗜果刀孢菌对新疆其他主要树种的潜在危害,提高该病害的诊断和检测效率。[方法]本文将嗜果刀孢菌通过离体叶片接种至6科19种植物的健康叶片上,初步测定其致病性和寄主范围;参考tef1序列设计了嗜果刀孢菌的特异性引物;通过常规PCR和实时荧光PCR对76株嗜果刀孢菌和22株其它真菌进行特异性和灵敏度检测,并优化实时荧光PCR的反应体系;另外,应用所设计的特异性引物对田间自然发病样本和人工接种7、10、13、16、19、21、24、48 h后的野杏叶片样品进行常规PCR检测。[结果]15种植物叶片在接种嗜果刀孢菌5 d后出现明显病斑,不同寄主的病斑大小存在极显著性差异(P<0.01),其中新疆小叶白蜡的病斑面积最大,达28.99 mm~2,而紫叶矮樱、黄果山楂、新疆杨、鞑靼桑等4种植物叶片未发病。本研究设计的特异性引物W0404-14-F/W0404-14-R扩增出的特异性条带为113 bp,对照及其它真菌无扩增条带。常规PCR检测的灵敏度为5.99×10~(-1)ng·μL~(-1)。在野杏叶片接种10 h后通过常规PCR可在叶片内检测到嗜果刀孢菌。[结论]嗜果刀孢菌可为害15种其他树种,具有潜在危害性;PCR快速检测方法检测嗜果刀孢菌速度快、特异性强,本研究首次探索了嗜果刀孢菌潜在寄主范围及P CR.快速检测方法,为由嗜果刀孢菌引起的穿孔病的诊断及检测提供了理论依据。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王婧 毕阳 朱艳 韩舜愈 祝霞 盛文军 李敏
【目的】建立nested-PCR方法,快速检测西瓜种子中的燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli,Aac),为西瓜细菌性果斑病(bacterial fruit blotch of watermelon,WFB)的防控提供技术支持。【方法】根据Aac BOX短重复序列的PCR产物设计两对引物BX-L1/BX-R5和BX-L1/BX-S-R2,建立以BX-L1/BX-R5为外侧引物,BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR,以5μL样品处理液于99℃高温裂解10 min,再放置冰上冷却5 min,以所释放病原DNA为模板进行PCR扩增...
关键词：
西瓜细菌性果斑病 西瓜种子 PCR 检测
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李华 祭芳 徐剑宏 王裕中 史建荣
【目的】建立快速、灵敏、有效的毒素检测方法,以保证麦类作物的安全生产以及谷物食品的安全性。【方法】以主要赤霉病菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)为对象,利用半琥珀酰化脱氧雪腐镰刀菌烯醇的牛血清蛋白偶联物(3-HS-DON-BSA)作免疫原,分别采用腹膜腔注射法和颈、背部多点注射法免疫Balb/c小鼠和豚鼠,获得DON的多抗血清,建立间接ELISA检测方法。【结果】多抗豚鼠血清的效价达到1∶6400,而小鼠混合血清的效价则为1∶12800。引起DON抗体最大结合50%抑制时,所需DON及其类似物3-Ac-DON和T-2毒素的量分别为63μg·ml-1、114μg·ml-1和>1000μg·ml-...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
孟佳佳 郭文博 聂冬霞 韦阳 赵志辉 韩铮
[目的]脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）是农产品中广泛存在的一种重要真菌毒素，给人和动物带来了较大的安全风险。目前关于DON标准物质的研究主要集中在溶液标准物质和成分分析标准物质上，未见DON有证纯度标准物质的报道。本项目拟研制DON国家级纯度标准物质，为农产品中DON的检测等工作提供物质基础。[方法]利用质量平衡法和定量核磁法两种不同原理的方法对DON纯度标准物质进行纯度定值。质量平衡法包括利用液相色谱面积归一化法进行DON主成分含量测定，卡尔费休库仑法进行纯度标准物质中水分含量的测定，顶空气相色谱-质谱法进行挥发性杂质含量的测定，电感耦合等离子质谱法进行无机离子杂质含量测定。定量核磁法采用苯甲酸为内标，选择合适的共振峰，内标法定量标准物质的纯度。并对标准物质进行了均匀性、稳定性检测和不确定度评估。[结果]质量平衡法的纯度定值结果为99.47%，定量核磁法定值结果为99.45%，最终所研制的DON纯度标准物质的纯度为99.5%，扩展不确定度为0.4%，均匀性良好，且满足12个月以上的稳定性要求。[结论]研制的DON纯度标准物质符合国家标准物质技术规范，目前已被批准为国家一级标准物质，并已被用于小麦、玉米等农产品的实际检测过程。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
亓增军 裴自友 韩航如 陈佩度 刘大钧
以2003年长江中下游地区赤霉病大流行后收获的8个不同抗、感赤霉病小麦为材料,探讨DONtest HPLC在低毒素小麦选育中的利用价值,并揭示不同抗性小麦脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)含量的差异特点。研究结果表明,本方法具有快速、准确的特点,平均回收率达78.2%;不同抗性品种DON含量差异明显,3个抗病品种中望水白含量最低,3个中抗类型中扬麦158最低。高产毒素镰刀菌菌株接种鉴定结果进一步证实了这种差异。研究结果还表明,2003年江苏4个地区12份样本均受到不同程度污染,DON变幅为0.175～7.239mg·kg-1。自然发病条件下,病粒率与DON含量存在显著相关性,可以作为毒素选择的间接指...
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