【目的】明确东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)对密林熊蜂(Bombus patagiatus)的侵染性及致病机理。【方法】采用传统生物学和电镜超微结构观察的方法,结合qPCR定量分析对东方蜜蜂微孢子虫在密林熊蜂上的致病机理进行探讨。【结果】感染初期工蜂除取食减少和行动迟缓外无明显外观染病特征,感染后期工蜂萎靡、衰弱、飞翔无力。解剖后镜检发现中肠仅存少量孢子,但充满大量细菌;熊蜂肠道组织切片发现东方蜜蜂微孢子虫侵染中肠上皮细胞后导致核膨大并变形、线粒体体积变小甚至解体,内质网紊乱,但孢子只侵染寄主细胞质而不侵入细胞核,最终导致线粒体解体,细胞破裂;qPCR定量分析得出接种后3—4 ...

【目的】通过对意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)工蜂中肠响应东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)胁迫的差异表达基因(differentially expressed gene,DEG)及免疫通路进行深入细致的分析,揭示宿主的细胞和体液免疫应答,为关键免疫应答基因的筛选及功能研究打下基础。【方法】基于前期获得的正常及东方蜜蜂微孢子虫胁迫的意蜂7日龄和10日龄工蜂中肠(Am7CK、Am7T、Am10CK、Am10T)转录组数据,按照FDR≤1,P≤0.05和|log2 fold change|≥1的标准筛选出各组的DEG,利用相关生物信息学软件对DEG进行Pearson相关性分析、Venn分析、GO分类和KEGG代谢通路富集分析,进而对免疫通路富集基因进行统计和分析,利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-q PCR)验证转录组数据的可靠性。【结果】差异分析结果显示,Am7CK vs Am7T比较组包含472个上调基因和385个下调基因;Am10CK vs Am10T比较组包含611个上调基因和360个下调基因。Venn分析结果显示,两个比较组特有的DEG分别为739和853个,共有的DEG为118个。GO分类结果显示,Am7CK vs Am7T比较组中上调和下调基因分别涉及23和29个功能条目,其中富集上调基因数最多的前5位分别为结合、催化活性、代谢进程、细胞进程和单组织进程;富集下调基因数最多的前5位分别为代谢进程、单组织进程、催化活性、细胞进程和结合。Am10CK vs Am10T比较组中上调和下调基因分别涉及36和26个功能条目,其中富集上调基因数最多的前5位分别为单组织进程、结合、细胞进程、催化活性和代谢活性;富集下调基因数最多的前5位分别为结合、细胞进程、催化活性、代谢进程和单组织进程。KEGG代谢通路富集分析结果显示,Am7CK vs Am7T比较组中上调和下调基因分别富集在38和33条代谢通路,富集上调基因数最多的前5条分别为胆汁分泌、内质网蛋白加工、泛素介导的蛋白水解、PI3K-Akt信号通路和神经营养因子信号通路;富集下调基因数最多的前5条分别为胞质DNA传感通路、嘌呤代谢、嘧啶代谢、RNA聚合酶和核糖体;涉及泛素介导的蛋白水解等3条细胞免疫通路,以及PI3K-Akt信号通路等7条体液免疫通路。Am10CK vs Am10T比较组中上调和下调基因分别富集在54和43条代谢通路,富集上调基因数最多的前5条分别为Hippo信号通路、药物代谢-细胞色素P450、P450对外源物质的代谢、泛素介导的蛋白水解和鞘脂类代谢;富集下调基因数最多的前5条分别为m RNA监测、鞘脂类信号通路、果糖和甘露糖代谢、半乳糖代谢和鞘脂类代谢;涉及泛素介导的蛋白水解等7条细胞免疫通路,以及NF-κB信号通路等2条体液免疫通路。RT-q PCR验证结果显示6个随机挑选的DEG的表达量变化趋势与测序结果一致,证实了本研究中测序数据的可靠性。进一步分析发现意蜂7日龄和10日龄工蜂中肠的NF-κB信号通路均被东方蜜蜂微孢子虫激活,随即启动了3种抗菌肽apidaecin、defensin-1和hymenoptaecin的合成,体现了它们在宿主抵御东方蜜蜂微孢子虫入侵中的重要性。【结论】在转录组水平解析了意蜂工蜂中肠对东方蜜蜂微孢子虫的免疫应答,揭示宿主在胁迫前期同时作出细胞和体液免疫应答,前者可能在抵御病原入侵方面发挥主要作用;宿主的细胞免疫在胁迫后期持续增强,但体液免疫较大程度地减弱;泛素介导的蛋白水解通路及富集DEG,NF-κB信号通路及富集DEG,以及抗菌肽编码基因apidaecin、defensin-1和hymenoptaecin可能在意蜂工蜂对东方蜜蜂微孢子虫的免疫应答中起到关键作用。

【目的】通过对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的Rad18-like重组与DNA修复蛋白(Rad18-like recombination and DNA repair protein, RRDRP)进行系统进化分析，为进一步研究其功能提供理论依据。【方法】利用Protparam、ProtScale和SWISS-model等软件分析RRDRP的理化性质、亲水性和三级结构。利用SignalP 4.1 Server、NetPhos 3.1 Server、TMHMM和SOPMA等软件预测RRDRP的信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域及二级结构。使用PSORTⅡ软件预测RRDRP蛋白的亚细胞定位。使用MEME软件预测东方蜜蜂微孢子虫和其他物种RRDRP的保守基序。通过Mega 11.0软件对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的RRDRP进行氨基酸序列多重比对，并采用邻接法构建系统进化树。【结果】东方蜜蜂微孢子虫RRDRP基因含有2 928个核苷酸，可编码975个氨基酸，分子质量约11.50 ku,脂溶系数93.58,等电点6.63,分子式C_(5135)H_(8253)N_(1377)O_(1545)S_(34),平均亲水系数为-0.627,可同时定位于细胞核、细胞质、过氧化物酶体和细胞骨架；RRDRP包含55个磷酸化位点、678个α-螺旋、99条延长链、22个β-转角及176个无规则卷曲；RRDRP不含信号肽与跨膜结构域。东方蜜蜂微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、颗粒病微粒子虫等11个物种的RRDRP中均含有5个相同的保守基序(Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4和Motif 5)。东方蜜蜂微孢子虫与颗粒病微粒子虫在进化树上聚为一支，同源性较高。【结论】东方蜜蜂微孢子虫RRDRP是潜在的亲水性蛋白和胞内蛋白，在东方蜜蜂微孢子虫以及其他微孢子虫和真菌中高度保守。

基于前期已获得的意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)工蜂中肠转录组数据,在全转录组水平上对意大利蜜蜂的可变剪接基因(alternatively spliced gene, ASG)进行鉴定和分析,旨在揭示ASG在宿主响应东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)胁迫中的作用.在正常意大利蜜蜂7和10日龄工蜂中肠(Am7CK、Am10CK)和东方蜜蜂微孢子虫胁迫的意大利蜜蜂7和10日龄工蜂中肠(Am7T、Am10T)样品中检测到可变剪接事件数分别为73 383、85 618、79 813和74 693次,对应的基因数分别为9 586、10 063、9 829和9 622个,平均每个ASG上发生的可变剪接事件数分别为7.66、8.50、8.12和7.76次.各样品的可变剪接事件中外显子跨越的数量最多,分别为4 411、5 247、4 993和4 629个.Venn分析结果显示,Am7CK、Am10CK、Am7T和Am10T中的共有ASG数为9 056个,特有ASG数分别为100、153、275和95个.GO分类结果显示,这些共有ASG分布在50个功能条目,特有ASG分别分布于26、30、33和24个功能条目.KEGG代谢通路富集分析结果显示,上述共有ASG富集在325个代谢通路,包括内质网蛋白加工、核糖体和RNA转运等;特有ASG分别富集在31、104、126和22个代谢通路.研究结果提供了意大利蜜蜂响应东方蜜蜂微孢子虫胁迫过程中的ASG数量和种类信息,揭示宿主ASG在胁迫响应中参与了新陈代谢和细胞免疫,为关键ASG的筛选和功能研究建立了数据基础.

利用相关生物信息学软件对东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)的DNA拓扑异构酶3(DTⅢ)进行了理化性质、分子特性、保守基序、结构域和系统进化的分析。结果表明：DTⅢ包含805个氨基酸，分子式为C_(4267)H_(6719)N_(1117)O_(1240)S_(34),分子质量约为94.60 ku,脂溶系数为81.84,等电点为9.08,平均亲水系数为-0.595,亲水氨基酸多于疏水氨基酸，不含典型信号肽；含有41个丝氨酸磷酸化位点，23个酪氨酸磷酸化位点及14个苏氨酸磷酸化位点；包含310个α-螺旋，117个β-折叠，37个β-转角及341个无规则卷曲；可同时定位于细胞核、细胞质和线粒体；东方蜜蜂微孢子虫与其他10种微孢子虫的DTⅢ均含有5个相同的保守基序(Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4和Motif 5)和2个相同的结构域(Toprim和Topoisom＿bac);通过Mega 11.0软件构建东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的DTⅢ的系统进化树，结果显示东方蜜蜂微孢子虫与绒鳌蟹肝孢虫(Hepatospora eriocheir)的DTⅢ聚为一支，进化距离最近。研究结果明确了东方蜜蜂微孢子虫DTⅢ的理化性质和分子特性，并揭示东方蜜蜂微孢子虫与绒鳌蟹肠孢虫的DTⅢ亲缘关系最近，DTⅢ在东方蜜蜂微孢子虫和其他微孢子虫中具有较高的保守性。

采用SSUrRNA基因序列检测鉴定方法,初步调查了甘肃、青海、四川、内蒙古26种1008只熊蜂的微孢子虫感染情况及种类.结果表明:其中有16种210只被微孢子虫感染,感染率为20.8%,白背熊蜂和西伯熊蜂的微孢子虫感染率最高,红束熊蜂的感染率最低.内蒙古地区熊蜂微孢子虫的感染率最高,四川次之,甘肃与青海地区熊蜂的微孢子虫感染率最低.感染熊蜂的微孢子虫有熊蜂微孢子虫、东方蜜蜂微孢子虫和发现于鳞翅目卷叶蛾科寄主上的Nosema thomsoni.这说明微孢子虫对我国熊蜂的感染很广泛.

[目的]对前期鉴定所获得的东方蜜蜂微孢子虫的nce-miR-11248进行表达和序列验证,预测、分析其靶基因,并检测nce-miR-11248及其靶基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中的表达谱,为进一步开展nce-miR-11 248调控东方蜜蜂微孢子虫侵染的功能及作用机制研究提供参考。[方法]利用Stem-loop RT-PCR和Sanger测序验证nce-miR-11248的真实性;利用相关生物信息学软件预测nce-miR-1 1248的靶基因,并分析其编码蛋白的分子特性;使用MEME和TBtools软件预测SGT1蛋白的保守基序和结构域,通过Mega 11.0软件进行氨基酸序列多重比对,采用邻接法构建系统进化树。采集东方蜜蜂微孢子虫孢子侵染1,2,4,6和8 d的意蜂工蜂中肠组织,采用RT-qPCR检测nce-miR-11248及其靶基因SGT1的表达谱。[结果]nce-miR-11248在东方蜜蜂微孢子虫孢子中真实存在,其序列长度为25 bp。nce-miR-11248的靶基因为SGT1。SGT1蛋白分子式为C_(765) H_(1213)N_(195)O_(241)S_4,分子质量约为17.10 ku,脂溶系数为82.67,等电点为5.50,亲水系数为-0.709,不含典型的信号肽和跨膜结构域,可同时定位于细胞核、线粒体和过氧化物酶体。东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫、泛胞虫、肠脑炎微孢子虫和蚱蜢脑炎微孢子虫的SGT1中均含有4个保守基序(Motif 1、Motif 2、Motif 3和Motif 4)和1个结构域(SGT1超家族结构域)。东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫、肠脑炎微孢子虫和蚱蜢脑炎微孢子虫的SGT1聚为一支,且东方蜜蜂微孢子虫与家蚕微孢子虫的SGT1进化距离最近。相较于侵染东方蜜蜂微孢子虫后1 d,侵染后2,4,6和8 d nce-miR-11248的表达量均显著下调(P

【目的】本研究旨在为探究nce-miR-15338调控东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)侵染意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)工蜂的功能及作用机制提供参考和依据。【方法】采用Stem-loop RT-PCR和Sanger测序验证nce-miR-15338的存在和表达。利用相关软件预测nce-miR-15338的靶基因并进行数据库注释。通过RT-qPCR检测nce-miR-15338及其候选靶基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中的表达谱。【结果】nce-miR-15338在东方蜜蜂微孢子虫孢子中真实存在和表达；nce-miR-15338共靶向LCFAL 2和20s PS等16个基因；分别有16、7、8、3个靶基因可注释到Nr、Swiss-Prot、GO和KEGG数据库；相较于接种后1 d, nce-miR-15338的表达量在2 d极显著上调，在4、6、8 d均极显著下调；LCFAL 2的表达量在接种2、4、6、8 d后皆为极显著下调；20s PS在接种2、4、6、8 d的表达水平均为极显著下调。【结论】研究结果证实了nce-miR-15338的真实存在和表达，并明确了东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中nce-miR-15338及其候选靶基因LCFAL 2和20s PS的表达规律。

对东方蜜蜂微孢子虫RCDP 42基因进行分子克隆，并通过生物信息学解析RCDP 42蛋白的分子特性，进而对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的RCDP 42蛋白进行保守基序和结构域预测及分析。结果表明，成功克隆到东方蜜蜂微孢子虫RCDP 42基因的CDS区，RCDP 42基因在孢子中真实表达，含有540个核苷酸，可编码179个氨基酸；RCDP 42蛋白的分子质量约为20.3 ku,分子式为C_(915)H_(1416)N_(230)O_(274)S_(10),脂溶系数为86.03,等电点为6.57;包含的亲水氨基酸数量多于疏水氨基酸，但不含信号肽与跨膜结构域，说明RCDP 42可能为亲水性蛋白、胞内蛋白和非跨膜蛋白，可能包含16个磷酸化位点、63个α-螺旋、43条延长链、11个β-转角及62个无规则卷曲。在东方蜜蜂微孢子虫、蚱蜢脑炎微孢子虫和肠脑炎微孢子虫的RCDP 42蛋白中均鉴定到3个保守基序(motif 1、motif 2和motif 3)与1个结构域(Rho)。

【目的】探明nce-miR-26675通过靶向调控蛋白转运体NcSec24基因的表达参与东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂的过程，为其侵染意大利蜜蜂工蜂的机制提供依据。【方法】联用RNAhybrid、miRanda和TargetScan软件预测nce-miR-26675的靶基因，取交集作为靶基因集合。使用Blast工具将靶基因比对到基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库以获得相应的功能和通路注释。采用RT-qPCR检测东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中nce-miR-26675和NcSec24的表达谱。利用Expasy网站上的相关软件预测和分析NcSec24的理化性质和分子特性。分别使用MEME和TBtools软件鉴定东方蜜蜂微孢子虫和其他物种NcSec24蛋白的保守基序和结构域。通过Mega 11.0软件对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的NcSec24蛋白进行氨基酸序列多重比对，并采用邻接法构建了基于NcSec24蛋白的系统进化树。【结果】nce-miR-26675靶向NcSec24等13个基因，其中，10个靶基因可注释到GO中的37个功能条目，6个基因注释KEGG中的23条KEGG通路。与接种后1 d相比，nce-miR-26675的表达量在接种后2 d显著上调（P<0.05）,在接种后3、4 d显著下调（P<0.05）,呈现先上升再下降的趋势；NcSec24的表达量在接种后2、3、4 d均显著下调（P<0.05）,表现出持续下降的趋势。NcSec24的分子质量约为80.419 ku,等电点为5.60,分子式为C₃₆₇₁H₅₆₅₃N₈₉₇O₁₀₆₇S₃₁,平均亲水系数为-0.035; NcSec24不含典型信号肽，可同时定位于细胞核和细胞质；NcSec24含4个结构域（Sec23＿trunk、Sec23＿helical、zf-Sec23＿Sec24和Sec23＿BS）与5个保守基序（motif1、motif2、motif3、motif4和motif5）;东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫、颗粒病微孢子虫、泰氏康罗汉孢虫的NcSec24聚为一支。【结论】nce-miR-26675通过靶向调控NcSec24的表达参与东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂的过程。NcSec24是潜在的亲水性蛋白和胞内蛋白，东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫、颗粒病微孢子虫和泰氏康罗汉孢虫的NcSec24同源性较高。

从各地的蜜蜂和植物花上得到70多个螺原体(spiroplasma)分离物.用微量注射法接种健康蜜蜂,证明在蜜蜂和植物花上分离到的螺原体均对蜜蜂致病,并引起死亡.每头蜜蜂接种量:蜜蜂代表分离物Hs-1为1.4×10~7,荆条花的分离物 Fs-14为3.4×10~8,接种后3～6d,供试蜜蜂100%死亡,而对照蜜蜂全部存活.血清学的变形试验和 ELISA 方法测定各螺原体分离物血清学关系的结果,证明蜜蜂螺原体的抗血清,对蜜蜂上和植物花上分离到的螺原体大多数分离物都呈阳性反应,但反应强弱有明显差异,说明其间血清学关系比较复杂.根据以前的研究和本实验的结果,目前我国在蜜蜂上和植物花上分离到的螺原体,主...

采用PCR扩增、克隆与测序的方法,对重庆东南地区引起意大利蜜蜂(意蜂)蜂群出现明显下降趋势的病原微孢子虫的遗传标记基因SSU r DNA(小亚基核糖体脱氧核糖核酸,small subunit ribosomal DNA)和ITS(内转录间隔区,internal transcribed spacer)以及3个单拷贝座位分子标记肌动蛋白基因(Actin),热激蛋白基因(Hsp70)和RNA聚合酶基因(RPB1)进行分子水平扩增及测定,并与国内外不同地理分布的蜜蜂微孢子虫种群进行了分子遗传多样性比较及单倍型分析。结果显示,该蜜蜂微孢子虫分离种群为东方蜜蜂微孢子虫,命名为CQYX。序列分析表明东方蜜蜂...

对明亮熊蜂和意大利蜜蜂在温室凯特杏园的传粉生物学特性进行研究.结果表明,这2种蜂都可以代替人工弹花为温室杏园提供有效的传粉服务,但其传粉生物学特性不同.明亮熊蜂的趋光性差,适应温室环境能力强,活动起点温度为8.3℃,晴天日工作时间为7.85 h,访花速度为10.70朵.min-1;偏爱采集花粉,平均携粉率为31.59%.意大利蜜蜂的趋光性强,喜欢访问树冠上部的花朵;其活动受温度和光照条件的影响较大,在温度低于15℃的阴雪天气传粉活动停止,晴天日工作时间为5.34 h,访花速度为8.80朵.min-1;偏爱采集花蜜,平均携粉率仅为11.08%.因此,在低温条件下明亮熊蜂的传粉效果比意大利蜜蜂好.

为获得东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)的NCRBL-081基因序列,并对NCRBL-081编码蛋白进行预测和分析。本研究利用RT-PCR克隆NCRBL-081基因,利用相关生物信息学工具对NCRBL-081编码蛋白进行预测。结果表明:NCRBL-081共含有630个核苷酸,可编码含209个氨基酸的亲水性蛋白;NCRBL-081编码蛋白含有1个信号肽,6个明显的丝氨酸,5个酪氨酸磷酸化位点及1个跨膜结构域;该蛋白含有20.10%的α螺旋,8.61%的β折叠,25.84%的延伸链及45.45%的无规卷曲,且具有Ⅱ型核糖体失活蛋白家族的典型特征;同一个微孢子虫物种的不同RBL蛋白之间进化距离较近,而不同微孢子虫物种的RBL蛋白之间进化距离较远;东方蜜蜂微孢子虫的NCER_100581与AAJ76_100008081之间亲缘关系较近。研究结果解析了东方蜜蜂微孢子虫NCRBL-081的序列,并揭示了东方蜜蜂微孢子虫NCRBL-081编码蛋白的分子特征,可为后续功能探究提供依据。

利用前期获得的中华蜜蜂(Apis cerana cerana)幼虫肠道转录组数据对东方蜜蜂(Apis cerana)基因组的已注释基因进行结构优化、对未注释的新基因进行预测、分析和鉴定:利用Cufflink软件对reads进行转录本重构,通过与参考转录本序列进行比较,共对3 366个东方蜜蜂的基因结构进行了优化;利用Cuffcompare软件将重构转录本与参考基因组进行比对,共预测出527个东方蜜蜂的新基因,其中234个新基因在Nr数据库中存在注释信息;随机选取12个新基因进行PCR鉴定,有11个能够扩增出符合预期的目的片段,表明多数预测出的新基因真实存在;GO分类和KEGG代谢通路分析结果显示上述新基因可能在东方蜜蜂的生长发育、物质代谢、遗传信息传递等方面具有重要功能。本研究结果丰富和完善了东方蜜蜂基因组的基因结构与功能注释信息,也为新基因的功能研究打下基础。