【目的】本研究旨在为探究nce-miR-15338调控东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)侵染意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)工蜂的功能及作用机制提供参考和依据。【方法】采用Stem-loop RT-PCR和Sanger测序验证nce-miR-15338的存在和表达。利用相关软件预测nce-miR-15338的靶基因并进行数据库注释。通过RT-qPCR检测nce-miR-15338及其候选靶基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染过程中的表达谱。【结果】nce-miR-15338在东方蜜蜂微孢子虫孢子中真实存在和表达；nce-miR-15338共靶向LCFAL 2和20s PS等16个基因；分别有16、7、8、3个靶基因可注释到Nr、Swiss-Prot、GO和KEGG数据库；相较于接种后1 d, nce-miR-15338的表达量在2 d极显著上调，在4、6、8 d均极显著下调；LCFAL 2的表达量在接种2、4、6、8 d后皆为极显著下调；20s PS在接种2、4、6、8 d的表达水平均为极显著下调。【结论】研究结果证实了nce-miR-15338的真实存在和表达，并明确了东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中nce-miR-15338及其候选靶基因LCFAL 2和20s PS的表达规律。

【目的】探明nce-miR-26675通过靶向调控蛋白转运体NcSec24基因的表达参与东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂的过程，为其侵染意大利蜜蜂工蜂的机制提供依据。【方法】联用RNAhybrid、miRanda和TargetScan软件预测nce-miR-26675的靶基因，取交集作为靶基因集合。使用Blast工具将靶基因比对到基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库以获得相应的功能和通路注释。采用RT-qPCR检测东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中nce-miR-26675和NcSec24的表达谱。利用Expasy网站上的相关软件预测和分析NcSec24的理化性质和分子特性。分别使用MEME和TBtools软件鉴定东方蜜蜂微孢子虫和其他物种NcSec24蛋白的保守基序和结构域。通过Mega 11.0软件对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的NcSec24蛋白进行氨基酸序列多重比对，并采用邻接法构建了基于NcSec24蛋白的系统进化树。【结果】nce-miR-26675靶向NcSec24等13个基因，其中，10个靶基因可注释到GO中的37个功能条目，6个基因注释KEGG中的23条KEGG通路。与接种后1 d相比，nce-miR-26675的表达量在接种后2 d显著上调（P<0.05）,在接种后3、4 d显著下调（P<0.05）,呈现先上升再下降的趋势；NcSec24的表达量在接种后2、3、4 d均显著下调（P<0.05）,表现出持续下降的趋势。NcSec24的分子质量约为80.419 ku,等电点为5.60,分子式为C₃₆₇₁H₅₆₅₃N₈₉₇O₁₀₆₇S₃₁,平均亲水系数为-0.035; NcSec24不含典型信号肽，可同时定位于细胞核和细胞质；NcSec24含4个结构域（Sec23＿trunk、Sec23＿helical、zf-Sec23＿Sec24和Sec23＿BS）与5个保守基序（motif1、motif2、motif3、motif4和motif5）;东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫、颗粒病微孢子虫、泰氏康罗汉孢虫的NcSec24聚为一支。【结论】nce-miR-26675通过靶向调控NcSec24的表达参与东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂的过程。NcSec24是潜在的亲水性蛋白和胞内蛋白，东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫、颗粒病微孢子虫和泰氏康罗汉孢虫的NcSec24同源性较高。

[目的]对前期鉴定所获得的东方蜜蜂微孢子虫的nce-miR-11248进行表达和序列验证,预测、分析其靶基因,并检测nce-miR-11248及其靶基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中的表达谱,为进一步开展nce-miR-11 248调控东方蜜蜂微孢子虫侵染的功能及作用机制研究提供参考。[方法]利用Stem-loop RT-PCR和Sanger测序验证nce-miR-11248的真实性;利用相关生物信息学软件预测nce-miR-1 1248的靶基因,并分析其编码蛋白的分子特性;使用MEME和TBtools软件预测SGT1蛋白的保守基序和结构域,通过Mega 11.0软件进行氨基酸序列多重比对,采用邻接法构建系统进化树。采集东方蜜蜂微孢子虫孢子侵染1,2,4,6和8 d的意蜂工蜂中肠组织,采用RT-qPCR检测nce-miR-11248及其靶基因SGT1的表达谱。[结果]nce-miR-11248在东方蜜蜂微孢子虫孢子中真实存在,其序列长度为25 bp。nce-miR-11248的靶基因为SGT1。SGT1蛋白分子式为C_(765) H_(1213)N_(195)O_(241)S_4,分子质量约为17.10 ku,脂溶系数为82.67,等电点为5.50,亲水系数为-0.709,不含典型的信号肽和跨膜结构域,可同时定位于细胞核、线粒体和过氧化物酶体。东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫、泛胞虫、肠脑炎微孢子虫和蚱蜢脑炎微孢子虫的SGT1中均含有4个保守基序(Motif 1、Motif 2、Motif 3和Motif 4)和1个结构域(SGT1超家族结构域)。东方蜜蜂微孢子虫、家蚕微孢子虫、肠脑炎微孢子虫和蚱蜢脑炎微孢子虫的SGT1聚为一支,且东方蜜蜂微孢子虫与家蚕微孢子虫的SGT1进化距离最近。相较于侵染东方蜜蜂微孢子虫后1 d,侵染后2,4,6和8 d nce-miR-11248的表达量均显著下调(P

【目的】前期已对意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)7日龄工蜂中肠(Am7)、10日龄工蜂中肠(Am10)进行全转录组测序,本研究基于高质量的组学数据探究中肠发育过程中的差异基因表达谱及其调控网络,以期解析意蜂工蜂中肠发育的分子机理。【方法】根据FPKM(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)算法计算基因表达量,并以|log2 fold change|≥1且P≤0.05作为标准筛选得到差异表达基因(differentially expressed gene,DEG)。利用TargetFinder软件预测ame-miR-6001-3p的靶mRNA。利用相关生物信息学软件,对全部DEG进行GO和KEGG数据库注释。筛选出与AMPK、P13K-Akt、Wnt、cAMP、FoxO、Hippo、mTOR、Jak-STAT、Toll-like受体、TGF-beta、Notch、MAPK和NF-κB 13条信号通路存在富集关系的DEG,以及与ame-miR-6001-3p存在靶向结合关系的DEG,通过Cytoscape软件构建调控网络将其富集关系与调控关系可视化。利用茎环反转录PCR(Stem loop RT-PCR)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)验证ame-miR-6001-3p以及DEG在Am7和Am10中的差异表达情况。【结果】Am7 vs Am10比较组中共有1 038个DEG,包括515个上调基因和523个下调基因。这些DEG涉及细胞进程、代谢进程和催化活性等功能条目,并显著富集在氧化磷酸化、氨基糖与核苷酸糖代谢、脂肪酸代谢和嘌呤代谢等能量和物质代谢通路,表明工蜂中肠内存在旺盛细胞生命与新陈代谢活动。表达量聚类分析发现分别有20、18、15和14个DEG富集在AMPK信号通路、P13K-Akt信号通路、内吞作用和Hippo信号通路。57个DEG与P13K-Akt、Wnt、Jak-STAT等上述13条与生长发育和免疫防御相关的信号通路存在富集关系,且1个DEG可与多条信号通路存在富集关系。调控网络分析结果显示,分别有54个上调基因和44个下调基因可被ame-miR-6001-3p靶向结合;上调基因富集在磷酸肌醇代谢、胰岛素信号通路、Hippo信号通路和谷胱甘肽代谢等43条代谢通路,而下调基因富集在Hippo信号通路、新陈代谢途径、谷胱甘肽代谢和花生四烯酸代谢等20条代谢通路。RT-qPCR结果显示随机挑选的6个DEG的表达量变化趋势与测序数据一致,证实了本研究中基因差异表达真实可靠。此外ame-miR-6001-3p在Am7和Am10内均真实表达,并在Am10中的相对表达量显著较低。【结论】对意蜂工蜂中肠发育过程的DEG表达谱和DEG与ame-miR-6001-3p之间的调控关系,以及DEG的潜在作用进行深入分析和探讨,发现DEG可参与TGF-beta、Wnt、Hippo、Notch、PI3K-Akt、mTOR、AMPK和NF-κB等各类信号通路进而影响中肠的生长发育和免疫防御,DEG可通过与显著下调表达的ame-miR-6001-3p形成复杂的调控网络参与意蜂工蜂中肠发育过程中胰岛素信号通路等多条代谢途径。

基于前期已获得的意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)工蜂中肠转录组数据,在全转录组水平上对意大利蜜蜂的可变剪接基因(alternatively spliced gene, ASG)进行鉴定和分析,旨在揭示ASG在宿主响应东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)胁迫中的作用.在正常意大利蜜蜂7和10日龄工蜂中肠(Am7CK、Am10CK)和东方蜜蜂微孢子虫胁迫的意大利蜜蜂7和10日龄工蜂中肠(Am7T、Am10T)样品中检测到可变剪接事件数分别为73 383、85 618、79 813和74 693次,对应的基因数分别为9 586、10 063、9 829和9 622个,平均每个ASG上发生的可变剪接事件数分别为7.66、8.50、8.12和7.76次.各样品的可变剪接事件中外显子跨越的数量最多,分别为4 411、5 247、4 993和4 629个.Venn分析结果显示,Am7CK、Am10CK、Am7T和Am10T中的共有ASG数为9 056个,特有ASG数分别为100、153、275和95个.GO分类结果显示,这些共有ASG分布在50个功能条目,特有ASG分别分布于26、30、33和24个功能条目.KEGG代谢通路富集分析结果显示,上述共有ASG富集在325个代谢通路,包括内质网蛋白加工、核糖体和RNA转运等;特有ASG分别富集在31、104、126和22个代谢通路.研究结果提供了意大利蜜蜂响应东方蜜蜂微孢子虫胁迫过程中的ASG数量和种类信息,揭示宿主ASG在胁迫响应中参与了新陈代谢和细胞免疫,为关键ASG的筛选和功能研究建立了数据基础.

【目的】微小RNA(microRNA,miRNA)是一类重要的基因表达调控因子,可影响宿主与病原间的互作过程。蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)是一种特异性侵染蜜蜂幼虫的致死性真菌病原。本研究旨在对意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)幼虫肠道在球囊菌胁迫前期的差异表达miRNA(differentially expressed miRNA,DEmiRNA)及其靶基因进行深入分析,在miRNA组学水平探究意蜂幼虫在球囊菌侵染前期的胁迫应答,并通过构建显著DEmiRNA的调控网络筛选出与宿主应答相关的关键miRNA。【方法】利用small RNA-seq(sRNA-seq)技术对正常及球囊菌侵染的意蜂4日龄幼虫肠道(AmCK和AmT)进行高通量测序,首先对原始数据进行质控和评估,随后将过滤后的数据与西方蜜蜂(Apis mellifera)参考基因组进行比对;将比对上的序列标签(tags)注释到miRBase数据库,得出已知miRNA的表达量;通过TPM(tags per million)算法对各样本中miRNA的表达量进行归一化处理,以|log_2 fold change|≥1且P≤0.05作为标准筛选得到显著DEmiRNA;利用TargetFinder软件预测显著DEmiRNA的靶基因,并对其进行GO和KEGG代谢通路(pathway)富集分析。利用Cytoscape软件对miRNA-mRNA调控网络进行可视化。最后,利用茎环反转录PCR(Stem-loop RT-PCR)和荧光定量PCR(qPCR)验证测序数据的可靠性。【结果】AmCK和AmT样品的测序分别得到13 553 302和10 777 534条原始读段(raw reads),经严格过滤后得到的有效读段(clean reads)数分别为13 186 921和10 480 913条。各样品的生物学重复间的Pearson相关性系数分别在0.9822和0.9508以上。共有10个显著DEmiRNA,包括4个上调miRNA和6个下调miRNA。显著DEmiRNA在AmT的整体表达水平低于AmCK。10个显著DEmiRNA可靶向结合3 788个靶基因,其中上调miRNA的1 240个靶基因可注释到GO数据库中的39个GO条目,主要富集在结合、细胞进程、代谢进程和应激反应等;下调miRNA的749个靶基因可注释到34个GO条目,主要富集在细胞进程、结合、代谢进程和应激反应等。KEGG数据库注释结果显示,上调miRNA和下调miRNA的靶基因分别注释到95和66条代谢通路,富集基因数最多的分别是Wnt信号通路、Hippo信号通路、光传导以及内吞作用、磷脂酰肌醇信号系统、嘌呤代谢。对于上调和下调miRNA,分别有31和52个靶基因注释到内吞作用,15和7个靶基因注释到泛素介导的蛋白水解,11和5个靶基因注释到Jak-STAT信号通路,1和3个靶基因注释到MAPK信号通路。显著DEmiRNA与靶mRNA之间形成复杂的调控网络,7个显著DEmiRNA靶向结合96个与Wnt信号通路相关的mRNA,8个显著DEmiRNA靶向结合55个与内吞作用相关的mRNA。Stem-loop RT-PCR和qPCR结果验证了测序数据的可靠性。【结论】对意蜂幼虫肠道在球囊菌侵染前期的DEmiRNA及其靶基因进行预测和分析,并构建和分析了DEmiRNA-mRNA调控网络,研究结果提供了宿主miRNA的表达谱和差异表达信息,揭示了DEmiRNA通过调控细胞生命活动、新陈代谢以及部分细胞和体液免疫等生物学过程参与宿主的胁迫应答。miR-4331-y、miR-4968-y、miR-8440-y、novel-m0023-5p和novel-m0025-3p共同参与了宿主的Wnt信号通路和内吞作用的调控,可作为白垩病治疗的潜在分子靶标。

【目的】微小RNA(microRNA,miRNA)是一类在转录后水平对mRNA进行负调控的关键调控因子。本研究旨在通过分析意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)幼虫肠道发育过程中差异表达miRNA(differentially expressed miRNA,DEmiRNA)及其调控网络,提供miRNA的表达谱和差异表达信息,揭示DEmiRNA在幼虫肠道发育中的作用。【方法】利用small RNA-seq(sRNA-seq)技术对意蜂4、5和6日龄幼虫肠道样品(Am4、Am5和Am6)进行测序,将质控后的数据与西方蜜蜂(Apis mellifera)参考基因组进行比对,然后将比对上的序列标签(tags)注释到miRBase数据库,并利用TPM(tags per million)算法归一化处理所得miRNA的表达量,再通过相关生物信息学软件对miRNA进行表达量聚类、前体二级结构预测及差异表达分析。利用TargetFinder软件预测DEmiRNA的靶基因,使用Blast软件对靶基因进行GO和KEGG数据库注释,进而通过Cytoscape软件构建mi RNA-m RNA的调控网络。采用茎环实时荧光定量PCR(Stem-loop RT-qPCR)验证测序数据的可靠性。【结果】意蜂幼虫肠道样品的测序分别得到10 841 644、12 037 678和9 230 496条有效序列标签;Am4 vs Am5比较组包含16个上调和10个下调mi RNA,Am5 vs Am6比较组包含5个上调和7个下调mi RNA。其中,novel-m0031-3p为两个比较组所共有,并结合5个与蜕皮激素诱导蛋白相关的靶基因;二者的特有DEmi RNA数分别为25和11个。Am4 vs Am5的26个DEmi RNA结合5 742个靶基因,其中2 725个靶基因可注释到GO数据库中的46个GO term,并主要富集在结合、细胞进程、代谢进程和单组织进程等;Am5 vs Am6的12个DEmi RNA结合3 733个靶基因,且其中2 725个靶基因富集在结合、细胞进程、单组织进程和代谢进程等41个GO term;此外,两个比较组中的DEmi RNA分别有1 046和676个靶基因可注释到116和92条KEGG代谢通路,且Am4 vs Am5比较组的DEmi RNA的靶基因富集在Wnt信号通路、Hippo信号通路、嘌呤代谢和内吞作用等通路上的数量均高于Am5 vs Am6比较组。进一步分析结果显示Am4 vs Am5中的上调和下调mi RNA可分别结合611和85个靶基因,其中ame-mi R-6052结合的靶基因数最多,可通过结合5个靶基因,参与对细胞色素P450的调控;mi R-281-x结合49个靶基因,并间接调控组氨酸代谢、TGF-β信号通路以及Hippo信号通路;Am5 vs Am6中的上调和下调mi RNA可分别结合43和431个靶基因,其中mi R-iab-4-x结合靶基因数量最多,并广泛参与调控背腹轴的形成、Hippo信号通路、Wnt信号通路、Fox O信号通路、Notch信号通路以及m TOR信号通路等与生长发育相关的通路。调控网络分析结果表明,DEmi RNA与靶基因间形成较为复杂的调控网络,DEmi RNA居于调控网络的中心位置,而m RNA位于调控网络的外周。最后,通过茎环实时荧光定量PCR对随机选取的3个DEmiRNA进行验证,结果证实了测序数据的可靠性。【结论】在全基因组水平对意蜂幼虫肠道的DEmi RNA及其靶基因进行预测和分析,并对DEmi RNA的调控网络进行构建及分析,发现意蜂幼虫通过调节包括ame-mi R-6052、miR-iab-4-x、mi R-281-x和novel-m0031-3p在内的多个mi RNA的表达水平对肠道生长和发育进行调控,研究结果不仅提供了意蜂肠道发育过程的mi RNA表达谱及差异表达信息,也为阐明意蜂幼虫肠道的发育机理打下基础。

【目的】通过对意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)工蜂中肠响应东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)胁迫的差异表达基因(differentially expressed gene,DEG)及免疫通路进行深入细致的分析,揭示宿主的细胞和体液免疫应答,为关键免疫应答基因的筛选及功能研究打下基础。【方法】基于前期获得的正常及东方蜜蜂微孢子虫胁迫的意蜂7日龄和10日龄工蜂中肠(Am7CK、Am7T、Am10CK、Am10T)转录组数据,按照FDR≤1,P≤0.05和|log2 fold change|≥1的标准筛选出各组的DEG,利用相关生物信息学软件对DEG进行Pearson相关性分析、Venn分析、GO分类和KEGG代谢通路富集分析,进而对免疫通路富集基因进行统计和分析,利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-q PCR)验证转录组数据的可靠性。【结果】差异分析结果显示,Am7CK vs Am7T比较组包含472个上调基因和385个下调基因;Am10CK vs Am10T比较组包含611个上调基因和360个下调基因。Venn分析结果显示,两个比较组特有的DEG分别为739和853个,共有的DEG为118个。GO分类结果显示,Am7CK vs Am7T比较组中上调和下调基因分别涉及23和29个功能条目,其中富集上调基因数最多的前5位分别为结合、催化活性、代谢进程、细胞进程和单组织进程;富集下调基因数最多的前5位分别为代谢进程、单组织进程、催化活性、细胞进程和结合。Am10CK vs Am10T比较组中上调和下调基因分别涉及36和26个功能条目,其中富集上调基因数最多的前5位分别为单组织进程、结合、细胞进程、催化活性和代谢活性;富集下调基因数最多的前5位分别为结合、细胞进程、催化活性、代谢进程和单组织进程。KEGG代谢通路富集分析结果显示,Am7CK vs Am7T比较组中上调和下调基因分别富集在38和33条代谢通路,富集上调基因数最多的前5条分别为胆汁分泌、内质网蛋白加工、泛素介导的蛋白水解、PI3K-Akt信号通路和神经营养因子信号通路;富集下调基因数最多的前5条分别为胞质DNA传感通路、嘌呤代谢、嘧啶代谢、RNA聚合酶和核糖体;涉及泛素介导的蛋白水解等3条细胞免疫通路,以及PI3K-Akt信号通路等7条体液免疫通路。Am10CK vs Am10T比较组中上调和下调基因分别富集在54和43条代谢通路,富集上调基因数最多的前5条分别为Hippo信号通路、药物代谢-细胞色素P450、P450对外源物质的代谢、泛素介导的蛋白水解和鞘脂类代谢;富集下调基因数最多的前5条分别为m RNA监测、鞘脂类信号通路、果糖和甘露糖代谢、半乳糖代谢和鞘脂类代谢;涉及泛素介导的蛋白水解等7条细胞免疫通路,以及NF-κB信号通路等2条体液免疫通路。RT-q PCR验证结果显示6个随机挑选的DEG的表达量变化趋势与测序结果一致,证实了本研究中测序数据的可靠性。进一步分析发现意蜂7日龄和10日龄工蜂中肠的NF-κB信号通路均被东方蜜蜂微孢子虫激活,随即启动了3种抗菌肽apidaecin、defensin-1和hymenoptaecin的合成,体现了它们在宿主抵御东方蜜蜂微孢子虫入侵中的重要性。【结论】在转录组水平解析了意蜂工蜂中肠对东方蜜蜂微孢子虫的免疫应答,揭示宿主在胁迫前期同时作出细胞和体液免疫应答,前者可能在抵御病原入侵方面发挥主要作用;宿主的细胞免疫在胁迫后期持续增强,但体液免疫较大程度地减弱;泛素介导的蛋白水解通路及富集DEG,NF-κB信号通路及富集DEG,以及抗菌肽编码基因apidaecin、defensin-1和hymenoptaecin可能在意蜂工蜂对东方蜜蜂微孢子虫的免疫应答中起到关键作用。

【目的】通过对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的Rad18-like重组与DNA修复蛋白(Rad18-like recombination and DNA repair protein, RRDRP)进行系统进化分析，为进一步研究其功能提供理论依据。【方法】利用Protparam、ProtScale和SWISS-model等软件分析RRDRP的理化性质、亲水性和三级结构。利用SignalP 4.1 Server、NetPhos 3.1 Server、TMHMM和SOPMA等软件预测RRDRP的信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域及二级结构。使用PSORTⅡ软件预测RRDRP蛋白的亚细胞定位。使用MEME软件预测东方蜜蜂微孢子虫和其他物种RRDRP的保守基序。通过Mega 11.0软件对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的RRDRP进行氨基酸序列多重比对，并采用邻接法构建系统进化树。【结果】东方蜜蜂微孢子虫RRDRP基因含有2 928个核苷酸，可编码975个氨基酸，分子质量约11.50 ku,脂溶系数93.58,等电点6.63,分子式C_(5135)H_(8253)N_(1377)O_(1545)S_(34),平均亲水系数为-0.627,可同时定位于细胞核、细胞质、过氧化物酶体和细胞骨架；RRDRP包含55个磷酸化位点、678个α-螺旋、99条延长链、22个β-转角及176个无规则卷曲；RRDRP不含信号肽与跨膜结构域。东方蜜蜂微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、颗粒病微粒子虫等11个物种的RRDRP中均含有5个相同的保守基序(Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4和Motif 5)。东方蜜蜂微孢子虫与颗粒病微粒子虫在进化树上聚为一支，同源性较高。【结论】东方蜜蜂微孢子虫RRDRP是潜在的亲水性蛋白和胞内蛋白，在东方蜜蜂微孢子虫以及其他微孢子虫和真菌中高度保守。

【目的】长链非编码RNA(lncRNA)在真核生物的基因表达、表观遗传和细胞周期调控等方面发挥重要功能。本研究旨在探究意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)工蜂中肠发育过程中lncRNA的表达谱及其作用。【方法】利用RNA-seq技术和链特异性建库方法对意蜂7和10日龄工蜂中肠(Am7、Am10)进行深度测序,下机的原始数据经过Perl脚本过滤得到高质量有效读段。利用bowtie工具将有效读段比对核糖体数据库,进一步利用Top Hat2软件将未比对到核糖体数据库上的数据比对到参考基因组。利用CPC和CNCI软件对转录本的编码能力进行预测。通过RT-PCR对部分lncRNA进行鉴定。利用edgeR软件进行差异表达lncRNA(DElncRNA)分析,进而预测lncRNA的上下游基因,并对上下游基因进行GO及KEGG代谢通路富集分析。联用RNAhybrid、Miranda和Target Scan软件预测DElncRNA靶向结合的mi RNA及mi RNA靶向结合的靶基因,并通过Cytoscape软件构建DElncRNAs-mi RNAs-m RNAs的调控网络。最后,通过RT-qPCR验证测序数据的可靠性。【结果】Am7和Am10的深度测序分别获得134 802 058和147 051 470条原始读段,经严格过滤分别得到134 166 157和146 293 288条有效读段;共得到3 890个DElncRNA,包括2 005个上调lncRNA与1 885个下调lncRNA。RT-PCR验证结果显示共有8个lncRNA能扩增出符合预期的目的片段,表明预测出的lncRNA真实存在。DElncRNA的上下游基因数为1 793个,它们涉及42个GO条目,包括代谢进程、发育进程、细胞进程、应激反应和免疫系统进程等;这些上下游基因还涉及251条代谢通路,包括碳代谢、嘌呤代谢和脂肪酸的生物合成等物质代谢通路,硫代谢、甲烷代谢和氧化磷酸化等能量代谢通路,Hippo信号通路、Wnt信号通路和Notch信号通路等信号通路,溶酶体、内吞作用和泛素介导的蛋白水解等细胞免疫通路,以及MAPK信号通路、Jak-STAT信号通路和NF-kappa B信号通路等体液免疫通路,上述结果表明DElncRNA在意蜂中肠发育过程中参与物质和能量代谢、细胞生命活动和免疫调控。进一步分析发现TCONS_00020918可通过调控西方蜜蜂王浆主蛋白1编码基因在意蜂工蜂中肠的营养吸收、级型分化中发挥功能。DElncRNA的调控网络分析结果显示DElncRNA与mi RNA、m RNA间存在复杂的调控关系,部分DElncRNA处于调控网络的中心位置且能靶向结合较多的mi RNA,也有部分mi RNA可被多个DElncRNA共同靶向,表明这些DElncRNA可能在中肠发育中发挥重要作用。随机挑取5个DElncRNA进行RT-qPCR验证,结果显示它们的表达量变化趋势与测序结果一致,证实了本研究测序数据的可靠性。【结论】差异表达长链非编码RNA(DElncRNA)广泛参与意蜂工蜂中肠的新陈代谢、细胞活动和免疫调控并作为竞争性内源RNA(ce RNA)发挥作用,研究结果为关键lncRNA的筛选和功能研究提供了必要的数据支持。

【目的】明确东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)对密林熊蜂(Bombus patagiatus)的侵染性及致病机理。【方法】采用传统生物学和电镜超微结构观察的方法,结合qPCR定量分析对东方蜜蜂微孢子虫在密林熊蜂上的致病机理进行探讨。【结果】感染初期工蜂除取食减少和行动迟缓外无明显外观染病特征,感染后期工蜂萎靡、衰弱、飞翔无力。解剖后镜检发现中肠仅存少量孢子,但充满大量细菌;熊蜂肠道组织切片发现东方蜜蜂微孢子虫侵染中肠上皮细胞后导致核膨大并变形、线粒体体积变小甚至解体,内质网紊乱,但孢子只侵染寄主细胞质而不侵入细胞核,最终导致线粒体解体,细胞破裂;qPCR定量分析得出接种后3—4 ...

对东方蜜蜂微孢子虫RCDP 42基因进行分子克隆，并通过生物信息学解析RCDP 42蛋白的分子特性，进而对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的RCDP 42蛋白进行保守基序和结构域预测及分析。结果表明，成功克隆到东方蜜蜂微孢子虫RCDP 42基因的CDS区，RCDP 42基因在孢子中真实表达，含有540个核苷酸，可编码179个氨基酸；RCDP 42蛋白的分子质量约为20.3 ku,分子式为C_(915)H_(1416)N_(230)O_(274)S_(10),脂溶系数为86.03,等电点为6.57;包含的亲水氨基酸数量多于疏水氨基酸，但不含信号肽与跨膜结构域，说明RCDP 42可能为亲水性蛋白、胞内蛋白和非跨膜蛋白，可能包含16个磷酸化位点、63个α-螺旋、43条延长链、11个β-转角及62个无规则卷曲。在东方蜜蜂微孢子虫、蚱蜢脑炎微孢子虫和肠脑炎微孢子虫的RCDP 42蛋白中均鉴定到3个保守基序(motif 1、motif 2和motif 3)与1个结构域(Rho)。

对健康和患病蜜蜂幼虫血淋巴进行SDS-PAGE电泳和蛋白酶、酯酶的活性染色,以研究蜜蜂球囊菌分泌的胞外酶种类及对蜜蜂侵染的作用.结果表明:健康蜜蜂幼虫血淋巴中的蛋白含量丰富,主要由4种高分子质量的蛋白组成,而患病幼虫血淋巴中的蛋白含量很少,主要蛋白组分被降解;在患病幼虫血淋巴中可以检测到健康幼虫所没有的多种蛋白酶和酯酶的活性.可见,蜜蜂球囊菌在侵染蜜蜂幼虫的过程中涉及到胞外酶的作用,这些胞外酶参与降解蜜蜂的组织,为蜜蜂球囊菌的生长提供营养.

利用相关生物信息学软件对东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)的DNA拓扑异构酶3(DTⅢ)进行了理化性质、分子特性、保守基序、结构域和系统进化的分析。结果表明：DTⅢ包含805个氨基酸，分子式为C_(4267)H_(6719)N_(1117)O_(1240)S_(34),分子质量约为94.60 ku,脂溶系数为81.84,等电点为9.08,平均亲水系数为-0.595,亲水氨基酸多于疏水氨基酸，不含典型信号肽；含有41个丝氨酸磷酸化位点，23个酪氨酸磷酸化位点及14个苏氨酸磷酸化位点；包含310个α-螺旋，117个β-折叠，37个β-转角及341个无规则卷曲；可同时定位于细胞核、细胞质和线粒体；东方蜜蜂微孢子虫与其他10种微孢子虫的DTⅢ均含有5个相同的保守基序(Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4和Motif 5)和2个相同的结构域(Toprim和Topoisom＿bac);通过Mega 11.0软件构建东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的DTⅢ的系统进化树，结果显示东方蜜蜂微孢子虫与绒鳌蟹肝孢虫(Hepatospora eriocheir)的DTⅢ聚为一支，进化距离最近。研究结果明确了东方蜜蜂微孢子虫DTⅢ的理化性质和分子特性，并揭示东方蜜蜂微孢子虫与绒鳌蟹肠孢虫的DTⅢ亲缘关系最近，DTⅢ在东方蜜蜂微孢子虫和其他微孢子虫中具有较高的保守性。

温度是影响蜜蜂发育的关键因子之一.为研究低温胁迫对西方蜜蜂幼虫基因表达的影响,利用高通量转录组测序技术分别对最适发育温度和低温处理的西方蜜蜂工蜂6日龄幼虫的基因表达情况进行分析,获得差异表达基因(DEGs),并对DEGs进行GO功能分类和KEGG富集分析.结果显示,低温处理后共检测到98个DEGs.GO功能分类显示,DEGs富集在21条二级GO功能注释上,富集最多DEGs的GO功能注释为结合、细胞进程、代谢进程、催化活性;KEGG富集分析显示,上调和下调DEGs分别富集在25和3条通路上,主要包括甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢、核黄素代谢、昆虫激素生物合成等代谢通路,以及与信号转导相关的Hippo、Notch等信号通路.qPCR结果显示,转录组测序获得的DEGs IP3K、Ex、CYP18A1、GOD、GCDH表达差异显著.本研究结果揭示西方蜜蜂工蜂6日龄幼虫主要通过提高抗氧化能力和减慢发育速度应对低温.