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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
任锡亮 李英 侯喜林 王枫
采用RT-PCR、巢式PCR、3′RACE和5′RACE技术,获得了不结球白菜L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶(GLDH)基因cDNA2 034 bp全长序列。以苏州青为材料,进行光及黑暗对照处理,观察GLDH活性和L-抗坏血酸含量的日变化规律。结果表明:随着光照时数的增加,不结球白菜L-抗坏血酸水平和GLDH活性升高,而在持续黑暗条件下植株的L-抗坏血酸含量和GLDH活性没有发现这种日变化,表明GLDH活性可能受光诱导调控。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
高红亮 李英 宋玉萍 马成英 侯喜林
根据植物中hpRNA(hairpin RNA)原理,选择GLDH基因cDNA序列同源性较低区域设计1对携带双酶切位点的特异引物,以不结球白菜‘苏州青’叶片为材料提取总RNA,利用RT-PCR技术克隆了GLDH基因片段。构建中间克隆载体,经过3次亚克隆将测序正确的GLDH基因片段分别以正向和反向两种形式插入到间隔基因YYT的两端,经鉴定已插入到植物表达载体中,成功地构建了干扰GLDH基因表达的RNAi植物双元表达载体pRNAi-GLDH,并将表达载体转化到农杆菌菌株LBA4404中,为深入研究GLDH基因功能提供有效的工具。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
郭春苗 李明军 马锋旺 梁东 张敏
【目的】了解苹果果实L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶(L-galactose-1-phosphate phosphatase,GPP)基因的特性,探索苹果GPP基因表达特性及其与抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)水平的关系。【方法】通过RT-PCR从苹果果实中克隆GPP全长cDNA,分析其序列特征,进行原核表达,制备GPP特异抗体,分析GPP mRNA及其蛋白表达水平与苹果不同组织AsA的关系。【结果】从‘嘎啦’苹果果实中克隆的GPP cDNA(GenBank登录号为FJ752240)包含的最大开放阅读框(open reading frame,ORF)为813 bp,编码270个氨基酸残...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
冯超 雷莹 刘永忠
利用同源序列法结合电子克隆技术,从温州蜜柑幼果中克隆到长度为2 111 bp的L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因(citGalLDH),GenBank登录号为FJ849840。生物信息分析表明该基因包含一个1 818 bp的开放阅读框,编码605个氨基酸,分子质量为68 628.63 u,等电点为8.727;柑橘GalLDH蛋白具备FAD_binding_4和ALO结构域,与杨树和拟南芥GalLDH蛋白的关系较近。所克隆的citGalLDH可为深入研究柑橘Vc合成分子机制奠定基础。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李林 陈丽 吴小婷 邵帅旭 李英 侯喜林 刘同坤
[目的]本文旨在研究不结球白菜Br CDF1基因的功能,验证其与CO启动子之间的调控关系,以及其在植物抽薹开花中所起的作用。[方法]以不结球白菜‘苏州青’为材料,采用酵母单杂交技术,验证Br CDF1转录因子与CO启动子是否能够结合;构建过表达载体p Early Gate101-Br CDF1,利用农杆菌介导法将过表达载体导入拟南芥中,筛选阳性苗,同时对阳性苗进行Western blot检测,观察转基因植株的表型变化;采用RT-q PCR技术,检测Br CDF1、CO、FT基因在转基因和野生型植株中不同时间点的相对表达量。[结果]酵母单杂交和β-半乳糖苷酶试验分析结果显示,Br CDF1转录因子和CO启动子之间具有较高的结合活性。Western blot检测结果表明:转基因拟南芥植株中的Br CDF1蛋白成功表达。RT-q PCR结果表明,Br CDF1基因在转基因植株中的相对表达量比野生型植株高;CO、FT基因在转基因植株中的相对表达量比野生型低,同时Br CDF1过表达植株较野生型开花晚。[结论]Br CDF1转录因子能与CO启动子结合,从而抑制CO、FT基因的表达,进而影响不结球白菜光周期开花途径。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
肖妮娜 马锋旺 张军科 梁东
L-半乳糖脱氢酶(L-Galactose dehydrogenase,GalDH)是维生素C合成的L-半乳糖途径中,催化L-半乳糖生成L-半乳糖内酯的关键酶。根据GenBank中登录的的GalDH cDNA序列设计1对扩增引物,以嘎拉苹果叶片为材料,采用RT-PCR法扩增出GalDH cDNA全长。将获得的基因片段克隆到pMD18-T载体上,转入大肠杆菌DH5α筛选阳性克隆,经酶切和PCR鉴定,并对插入片段进行序列分析,结果表明,本试验获得的cDNA片段长为1 111 bp,是苹果GalDH cDNA全长。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
任海波 刘同坤 袁敬平 吴小婷 王惠玉 侯喜林
[目的]本文旨在分析不结球白菜BcICE1基因的表达模式并探索其在冷胁迫中的功能。[方法]以不结球白菜品种‘NHCC001’为材料,采用同源克隆的方法获得BcICE1基因的全长序列,并进行生物信息学分析;对‘NHCC001’进行4℃低温和PEG-6000模拟干旱处理,检测BcICE1基因对胁迫的响应;构建过表达载体pEarly Gate-BcICE1,利用注射法将载体农杆菌菌液导入烟草细胞进行BcICE1基因的瞬时表达并检测;构建酵母诱饵载体p GBKT7-BcICE1,转化AH109验证其转录激活活性;将pEarly Gate-BcICE1农杆菌菌液利用蘸花法进行BcICE1基因的遗传转化,并用RT-qPCR和Western blot对阳性苗进行鉴定。通过RT-qPCR对BcICE1过表达拟南芥中冷胁迫相关基因的表达水平进行分析。[结果]克隆获得不结球白菜BcICE1基因,其含有1 338 bp的开放阅读框,编码466个氨基酸,相对分子质量为47.40×103,等电点为5.42;氨基酸的多序列比对和系统进化树结果表明,BcICE1蛋白与欧洲油菜、荠菜和拟南芥ICE1蛋白同源关系较近。亚细胞定位表明BcICE1蛋白定位在细胞核中,具有转录激活性且对冷胁迫与干旱胁迫有响应。BcICE1过表达株系能增强植株的抗寒性,同时在低温处理后BcICE1过表达植株中冷胁迫相关基因At CBF3和COR15A的表达量显著高于野生型植株。[结论]克隆并获得BcICE1过表达拟南芥植株,功能分析表明BcICE1基因能增强植株抗寒性。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
牛歆雨 雷玉山 梁东 马锋旺 王西锐
克隆猕猴桃果实L-半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因,可为揭示猕猴桃高抗坏血酸(AsA)含量的分子机制奠定基础。研究以猕猴桃果实为材料提取总RNA,采用RT-PCR法,克隆出L-GalLDH基因的cDNA片段857 bp和DHAR基因的cDNA片段594 bp并测序,根据测序结果推测其氨基酸序列,并与刺梨、拟南芥、花椰菜、甘薯和草莓等植物的GalLDH基因和DHAR基因氨基酸序列进行亲缘分析。结果表明,猕猴桃GalLDH基因氨基酸序列和核苷酸序列与刺梨的相似性高达88%,其在同源基因进化关系树中单独聚为一类;DHAR基因氨基酸序列和核苷酸序列与苹果的相似性高达...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
侯喜林 宋小明
系统总结了南京农业大学近60年来进行不结球白菜种质资源的研究与利用的进展。从研究方法,种质资源的调查、搜集和整理,形态学的观察研究,生物学特性的研究,园艺学分类法的提出,抗性鉴定与分析,主要经济性状的遗传动态,种质资源遗传多样性分析与核心种质构建,种质资源的利用等方面,论述了不结球白菜种质资源研究所取得的成果,并对该项研究进行了展望。
关键词：
不结球白菜 种质资源 研究 利用 展望
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
侯喜林
从生物技术育种 ,新材料的创制 ,研究方法的创新及主要经济性状遗传规律的研究等方面概述了不结球白菜育种研究新进展 ;并对发展趋势与展望进行了论述。
关键词：
不结球白菜 育种 进展
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
俞乐 刘拥海 彭新湘
应用RT-PCR技术从水稻叶片中克隆了水稻L-半乳糖内酯脱氢酶(GLDH)的全长基因.序列分析表明,水稻GLDH基因全长1752bp,亚克隆其部分成熟蛋白编码基因(789bp),利用基因重组技术构建了E.coli/pET30a-GLDHe,经酶切鉴定,DNA测序,证实重组质粒构建正确;将重组质粒转化大肠杆菌Rosseta,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析证实表达出相对分子质量约为36000的蛋白.用原核表达蛋白作为抗原免疫家兔制备抗体,用Westernblot检测抗体的特异性及效价,结果表明,抗体血清效价为1∶1000,在加IPTG诱导后的菌液中可以检测到相应的蛋白条带((相对分子质量为...
[期刊] 华北农学报
[作者]
高秀瑞 陈贵林 潘秀清 武彦荣
收获前,叶面喷施氨基酸(甘氨酸、异亮氨酸和脯氨酸)对不结球白菜生长及品质的研究表明,不结球白菜的生长基本不受氨基酸的影响,仅甘氨酸和异亮氨酸混合可显著增加植株产量。除三种氨基酸混合降低不结球白菜体内硝酸盐含量,叶面喷施氨基酸明显增加叶片及叶柄硝酸盐含量;叶片可溶性蛋白质含量各处理之间差异不大;游离氨基酸含量增加达65 82%～84 81%;而可溶性糖含量明显减少。叶片硝酸还原酶活性降低,全氮含量增加。
关键词：
不结球白菜 氨基酸 硝酸盐 品质
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
周颖 李燕 陶瑜 王建军 侯喜林 李英
[目的]本文旨在验证单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)多基因家族中MDHAR2基因的功能,以探索其对不结球白菜抗坏血酸(AsA)含量的影响。[方法]以不结球白菜‘苏州青’cDNA为模板,扩增BcMDHAR2基因的ORF全长,利用生物信息学分析其氨基酸序列;通过亚细胞定位研究BcMDHAR2在细胞中的表达位置,采用实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)检测非生物胁迫和激素处理下BcMDHAR2基因的表达量;通过病毒诱导的基因沉默(VIGS)验证该基因对抗坏血酸含量的影响。[结果]BcMDHAR2基因包含1个1 308 bp的开放式阅读框(ORF),编码435个氨基酸。进化树分析表明,BcMDHAR2蛋白与芜菁的进化关系最近。亚细胞定位显示,BcMDHAR2定位于细胞核和细胞质、细胞膜上。RT-qPCR表明,低温、盐胁迫、重金属离子以及外源激素处理下,在一定时间内BcMDHAR2表达量上调,随后下调。该基因对光周期有一定的响应,随着光照时间变长,表达量上调,黑暗后,BcMDHAR2表达量下调。BcMDHAR2基因沉默后植株中AsA含量降低,AsA循环中相关基因的表达量发生了一定变化,而植株中SOD活性升高。[结论]BcMDHAR2表达量随外界条件变化而变化,响应不同的激素诱导和胁迫,在不结球白菜中该基因正调控AsA含量。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张娅 黄天虹 张西林 刘同坤 侯喜林 李英
[目的]本文旨在研究不结球白菜BcSERK1基因及其在胚胎发生中的作用。[方法]采用同源克隆的方法从不结球白菜‘二桩白’中克隆到BcSERK1基因全长序列,利用生物信息学分析其结构特征,并与其他物种进行氨基酸序列比对和进化分析,同时利用基因枪介导的方法进行亚细胞定位;利用小孢子培养技术研究不结球白菜‘二桩白’和‘四九菜心’小孢子培养出胚情况;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析BcSERK1基因在2个品种不同组织和在小孢子胚胎发生早期的表达特征。[结果]BcSERK1含有1个1 878 bp开放阅读框,编码625个氨基酸。与其他物种的氨基酸序列比对和系统进化分析结果显示:BcSERK1在进化过程中保守程度较高,与甘蓝型油菜亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示:BcSERK1蛋白定位于细胞膜上。游离小孢子培养结果显示:‘二桩白’出胚率较高,每蕾6.67个胚,而‘四九菜心’不出胚。RT-qPCR结果表明:BcSERK1在2个品种不同组织中均有表达,除根外‘四九菜心’的组织中其表达量均低于‘二桩白’;在小孢子胚胎发生早期,BcSERK1基因在‘二桩白’不同培养时间的表达量均高于‘四九菜心’。[结论]BcSERK1蛋白在进化过程中保守性较高,定位于细胞膜上;SERK1基因在2个不结球白菜品种中的差异表达表明该基因对胚胎发生具有重要作用。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
荣子龙 侯喜林 史公军 肖栋 郝慧楠
采用RT-PCR、5'RACE和3'RACE方法,克隆得到了不结球白菜NJ074晚抽薹基因(BcFLC1)的cDNA全长序列。对BcFLC1基因所编码氨基酸序列的理化性质进行分析推测得到:该基因cDNA全长909bp,包含576bp的开放阅读框,编码191个氨基酸。不结球白菜BcFLC1蛋白功能域预测分析结果表明:该基因为MADS盒基因,其编码蛋白的1～60氨基酸属于MADS盒基因蛋白。荧光定量PCR分析表明:BcFLC1基因在不同生长发育阶段叶片中的表达情况不同,抽薹前高于抽薹后叶片中的表达量。BcFLC1基因在不同部位表达也存在差异,表达量从高到低依次为:叶、茎、花蕾、花和根。
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