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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张蓓 刘同坤 黄菲艺 邵帅旭 吴小婷 侯喜林
[目的]开花基因FT是开花通路下游关键基因。本文旨在研究不结球白菜BcFT的亚细胞定位及互作蛋白的筛选,深入了解不结球白菜BcFT的功能及其调控机制。[方法]构建亚细胞定位载体p EZS-NL-BcFT,利用亚细胞定位技术研究BcFT的空间表达。通过酵母双杂交技术筛选与BcFT互作的蛋白,构建酵母双杂交诱饵载体p GBKT7-BcFT,转化酵母Y2H Gold菌株,验证自激活性和自毒性。对不结球白菜酵母双杂交c DNA文库进行筛选,得到与BcFT互作的片段,并根据基因片段进行比对,以不结球白菜c DNA为
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
吴小婷 邵帅旭 李英 张昌伟 侯喜林 沈振国 刘同坤
[目的]本文旨在揭示CDF1基因在不结球白菜(Brassica rapa ssp.chinensis)抽薹开花过程中的调控机制,验证其是否与FKF1蛋白发生互作。[方法]以‘苏州青’为材料,采用同源克隆方法获得BrCDF1基因全长序列,并与其他物种进行氨基酸序列比对;将BrCDF1与报告基因YFP融合构建亚细胞定位载体p Early Gate101-BrCDF1-YFP,采用农杆菌介导的方法将其瞬时表达于本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片中;激光共聚焦显微镜观察,利用酵母双杂交和双分
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王惠玉 任海波 李林 刘同坤 程奕秋 侯喜林
[目的]本文旨在揭示不结球白菜GIGANTEA(GI)基因的功能,验证其与CONSTANS(CO)、FLOWERING LOCUS T(FT)基因之间的调控关系以及其在植物抽薹开花中的作用。[方法]以不结球白菜品种‘苏州青’为材料,提取RNA并反转录成cDNA,同源克隆BcGI基因,Gateway构建表达载体pEarleyGate101-BcGI-YFP,利用农杆菌介导法将表达载体注射入本氏烟草中,激光共聚焦显微镜观察其亚细胞定位。Gateway构建沉默载体BcGI-RNAi,利用农杆菌介导法将沉默载体导入拟南芥中,观察野生型和转基因植株抽薹期的表型变化。采用RT-qPCR技术,检测GI、CO、FT基因在转基因和野生型拟南芥植株抽薹期的基因表达量。[结果]通过同源克隆,得到BcGI基因,其含有1个3 516 bp的开放阅读框(ORF),编码1 171个氨基酸。亚细胞定位结果显示,BcGI定位于细胞核中。RT-qPCR结果表明,BcGI基因在沉默转基因植株中的相对表达量比野生型植株低;同时当GI基因表达受到抑制时,CO、FT基因在沉默转基因植株中的相对表达量也比野生型明显降低,沉默转基因植株与野生型相比表现为开花延迟且抽薹期莲座叶数明显增多。[结论]BcGI定位于细胞核,参与正向调控下游CO、FT基因的表达,进而影响不结球白菜光周期开花途径。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
刘路平 刘高峰 蒋程 侯喜林
[目的]本文旨在研究不结球白菜基因BcNAC036的亚细胞定位及高温胁迫下的表达分析，并探索其功能及调控机制。[方法]以不结球白菜‘苏州青’为试验材料，提取叶片总RNA并且反转录成cDNA，同源克隆BcNAC036的全长基因序列，运用在线软件工具对其进行生物信息学分析。采用同源重组的方法构建过表达载体pCAMBIA1302-BcNAC036-GFP，农杆菌介导法将构建的过表达载体注射入本氏烟草叶片背面，通过激光共聚焦显微镜观察其亚细胞表达部位。采用RT-qPCR技术检测高温处理下不结球白菜耐高温品种‘苏州青’和热敏感品种‘矮脚黄’以及转基因拟南芥体内BcNAC036基因的表达量。对转基因拟南芥进行高温处理并统计其成活率。[结果]同源克隆的方法获得BcNAC036基因，其开放阅读框（ORF）为840 bp，编码279个氨基酸，相对分子质量为32 154.83，等电点是8.96。氨基酸序列比对以及同源进化树分析结果显示，BcNAC036蛋白与芜菁、甘蓝型油菜NAC036蛋白同源关系较近。亚细胞定位结果显示，BcNAC036的亚细胞定位表达在细胞核。RT-qPCR表明，BcNAC036在耐高温和热敏感品种中表达差异较大且表达量均呈明显下降趋势。转基因拟南芥较野生型相比，其成活率显著较低。[结论]BcNAC036蛋白在细胞核表达，BcNAC036基因与不结球白菜耐高温性呈负相关。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
肖栋 韦艳萍 李英 侯喜林
[目的]本文旨在研究不结球白菜病程相关蛋白基因Bc PR5的结构与表达特征。[方法]通过RACE技术,从抗病品种‘苏州青’叶片克隆到Bc PR5基因的全长c DNA序列。采用RT-q PCR方法分析该基因在霜霉病菌诱导,水杨酸(SA)、茉莉酸(Me J)和脱落酸(ABA)等激素处理条件下的表达模式。SDS-PAGE技术分析该基因的原核表达特征。[结果]Bc PR5基因的c DNA全长为954 bp,其中开放阅读框长度为732 bp,共编码243个氨基酸,相对分子质量为26.1×103,理论等电点是9.3。氨基酸同源系统进化分析表明,不结球白菜Bc PR5基因与同属植物的进化关系相近,其中与大白菜第6号染色体上的基因同源性最高(100%)。RT-q PCR分析表明,抗病品种‘苏州青’和感病品种‘矮脚黄’在霜霉病菌和非生物胁迫(SA、Me J和ABA)诱导过程中,Bc PR5基因的表达量均呈先升高后降低的趋势,且抗病品种高于感病品种。原核表达结果表明,该蛋白在终浓度为1.0 mmol·L-1的IPTG诱导4 h后能实现融合蛋白的高效表达。[结论]Bc PR5在不结球白菜抗霜霉病防御反应中发挥着重要作用,研究结果为该基因的功能验证提供理论基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
彭浩然 蒲运丹 张永至 薛杨 武改霞 青玲 孙现超
【目的】前期研究显示To MV外壳蛋白(coat protein,CP)可以与烟草蛋白L(CP-interacting protein-L,IP-L)相互作用,本研究旨在明确To MV CP与IP-L的共定位情况、IP-L的组织表达和在To MV侵染条件下烟草IP-L及其编码蛋白的表达变化情况,为进一步明确IP-L的功能提供依据。【方法】通过双酶切法从笔者实验室构建保存的p GBKT7-CP和p GADT7-IP-L重组载体上切下To MV CP和IP-L目的片段,构建融合蛋白植物表达载体p PZP-IP
[期刊] 水产学报
[作者]
杨佳睿 郝彤 李倩一 孙金生
为了构建中华绒螯蟹代谢过程研究的系统工具，实验在已经构建的中华绒螯蟹蛋白互作网络的基础上，首先采用邻接节点注释法对未知蛋白的分子功能进行预测。随后采用GO回溯法，构建了代谢蛋白网络并对网络中蛋白分子功能、亚细胞定位和途径分布进行了分析。分子功能注释中，确定了932 个蛋白的分子功能，占所有未知分子功能蛋白的97%。最终构建的代谢蛋白互作网络包含2 045 个蛋白及这些蛋白之间的15 927 条互作关系。网络中94.2%（1 926/2 045）的蛋白具有亚细胞定位信息，大多分布于有膜细胞器中；96.1%的蛋白（1 966/2 045）具有分子功能信息，大多具有催化活性和结合活性。进一步对确定了分子功能和亚细胞定位的蛋白在40 个KEGG子系统中的分布进行分析，发现参与翻译和氨基酸代谢过程的蛋白较多，也有一部分参与免疫和运输过程。本文的研究结果可为中华绒螯蟹代谢相关的蛋白功能、定位方面的研究提供重要的数据参考，对系统研究中华绒螯蟹代谢过程及代谢相关疾病具有重要价值。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
刘世拓 肖栋 许玉超 侯喜林 徐玮玮 韩克 董慧杰 胡春梅
[目的]双半胱氨酸型硫氧还蛋白过氧化物酶Brc2-Cys Prx是过氧化还原蛋白Peroxiredoxins(Prxs)的亚家族。Prxs是植物抗氧化酶防御系统的成员,对清除植物体内活性氧具有重要作用。本文旨在克隆和研究Brc2-Cys Prx基因在不结球白菜处于不同胁迫条件下的表达模式。[方法]以不结球白菜霜霉病抗病自交系‘苏州青’和霜霉病感病自交系‘矮脚黄’为试验材料,利用RACE技术克隆得到不结球白菜Brc2-Cys Prx基因。利用生物信息学方法对该基因进行信息学分析。采用qRT-PCR技术对不结
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
郑佳秋 侯喜林 朱红芳
以不结球白菜暑绿为试材,研究了热激处理(42℃)诱导不结球白菜热激蛋白(BcHSP)合成与耐冷的相关性。结果表明:热激处理明显增强了不结球白菜幼苗的耐冷性,降低了膜伤害程度。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性含量增加,而丙二醛(MDA)含量下降。已从热激诱导的不结球白菜中克隆了小分子量BcHSP基因(日本DNA数据库DDBJ登录号:AB367955)。荧光实时定量PCR分析表明BcHSP的表达量与耐冷性相一致。低温(4℃)胁迫下,在大肠杆菌中异源表达BcHSP可维持大肠杆菌较高的细胞活力,这些结果表明BcHSP合成与不结球白菜耐冷性的提高有关。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
班青宇 耿建峰 侯喜林 成妍 王倩
用不结球白菜杂交品种暑绿的112个双单倍体纯系构建了包含186个分子标记的遗传连锁图谱,利用复合区间作图法检测了叶片脯氨酸含量和可溶性蛋白含量两性状的数量性状基因座(QTL)。结果表明:叶片脯氨酸含量由位于第5连锁群上与分子标记C20相距7.2cM的QTL控制,其加性效应和贡献率分别为0.37%和8.32%;可溶性蛋白含量由位于第3连锁群上与分子标记AE153相距0.8cM的QTL控制,其加性效应和贡献率分别为0.004%和8.12%。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
蒋大华 张茹佳 张昌伟 侯喜林
[目的]本文旨在克隆不结球白菜BcATPA(ATPase alpha subunit)基因并研究其功能及其在不育系和可育系中的表达差异。[方法]构建BcATPA重组质粒,在NCBI数据库进行核苷酸序列分析,得到不结球白菜ATPA基因全长序列。利用实时定量PCR技术检测BcATPA基因在不结球白菜保持系和不育系的不同组织和器官及不同小孢子发育时期的时空表达情况。[结果]获得了不结球白菜ATPA基因全长序列,命名为BcATPA。该基因的核苷酸序列全长为1 806 bp,其最大开放阅读框长度为1 527 bp,编码508个包含F1-ATP酶α亚基保守区域的氨基酸,并且含有ATP结合、walker A motif和walker B motif等位点,而且在287～315的位置含有29个氨基酸的跨膜区域。BcATPA与芸薹属中的芥菜、甘蓝型油菜和拟南芥亲缘关系特别近,二级结构和三级结构预测表明,该基因与ATP结合有关。实时荧光定量PCR结果表明,BcATPA在不育系中的表达水平高于保持系,在花瓣、萼片中表达水平较高。在整个小孢子发育时期,不育系中BcATPA基因表达量逐渐降低;而在保持系中,从四分体时期开始显著下降,因此不育系与保持系表达量差异逐渐加大。[结论]BcATPA基因在不结球白菜不育系和保持系的各个器官和整个小孢子发育时期的表达水平存在差异,研究结果为进一步研究BcATPA基因与细胞质雄性不育之间的关系提供了理论依据。
[期刊] 华北农学报
[作者]
单奇伟 陈龙正 徐海 宋波 安林海 胡俏强 苏小俊 袁希汉
对不结球白菜细胞质雄性不育系S2108A和Y3611A及其相应的保持系S2108B和Y3611B进行了花器官形态比较和花药发育细胞学观察,结果表明:两套不育系和保持系之间在花器官的多个性状上差异极显著,而两个不育系S2108A和Y3611A之间除花蕾大小、雌蕊长和花瓣长有差异外,其他均不显著,说明从不同不育源转育来的两个不育系在花器官外形上差异不大;两个不育系花药败育表现均起始于四分体时期,且由于绒毡层的液泡化和径向膨大,挤压四分体小孢子导致败育,表明败育与绒毡层的不正常发育有关。此外,与Y3611A不同,在不育系S2108A中还存在另一种败育形式,绒毡层细胞壁发生融合,成为紧贴药室壁的类似于...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
罗维玉 朱鹏阳 张杰 胡永浩 孔晖晖 梁立滨 周圆 李呈军 姜丽 陈化兰
【目的】构建肺组织细胞Ｃａｌｕ－３及ａ５４９的高质量酵母ＣＤＮａ文库并筛选与流感病毒ＮＰ蛋白相互作用的宿主因子，为深入研究流感病毒ＮＰ蛋白功能、病毒复制及致病机制奠定基础。【方法】提取等量Ｃａｌｕ－３及ａ５４９细胞的总ＲＮａ，混合后反转录生成ＣＤＮａ，利用长距离ＰＣＲ（ｌＤ－ＰＣＲ）扩增合成ＤｓＣＤＮａ，用ＣＨＲＯＭａ ｓＰＩＮＴＭ＋ＴＥ－４００纯化柱纯化ＤｓＤＮａ，按照ＣｌＯＮＴＥＣＨ公司的ＭａｋＥ ＹＯｕＲ ＯｗＮ＂ＭａＴＥ＆ＰｌａＴＥ＂ｌＩｂＲａＲＹ ｓＹｓＴＥＭ操作程序，将带有同源臂的ＤｓＣＤＮａ与线性化Ｐ ＧａＤＴ７－ＲＥＣ共同转化Ｙ１８７酵母感受态细胞，涂布ｓＤ／－ｌＥｕ平板后于３．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
余义和 李秀珍 郭大龙 杨英军 李学强 张国海
【目的】从葡萄中克隆细胞分裂素响应调节因子ＶＶＲＲ２，获得ＶＶＲＲ２的互作蛋白，为阐明ＶＶＲＲ２在欧洲葡萄抗病反应中的作用机制提供依据。【方法】对葡萄接种白粉病菌，提取总ＲＮＡ后反转录，利用实时荧光定量ＰＣＲ检测ＶＶＲＲ２转录本对白粉病菌的响应；构建瞬时表达载体Ｐ ＢＩ２２１－ＶＶＲＲ２－ＧＦＰ，转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析；构建酵母表达载体Ｐ ＧＢＫＴ７－ＶＶＲＲ２，转化酵母菌株ＡＨ１０９，检测ＶＶＲＲ２的转录激活活性；构建酵母表达Ｃ ＤＮＡ文库，以ＶＶＲＲ２为诱饵，通过ＭＡＴＩＮＧ法筛选互作蛋白，对获得候选序列进行ＢｌＡｓＴ分析；将候选蛋白ＶＶＴＧＡ的全长序列克隆至Ｐ ＧＡＤＴ７载．．．
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
申浩冉 肖栋 侯喜林
[目的]本文旨在克隆和研究不结球白菜BcVIL1基因在春化过程中的表达情况,初步了解不结球白菜BcVIL1基因的结构及功能。[方法]以普通白菜PC-175和菜心‘CX-49’为试验材料,利用RT-PCR技术克隆BcVIL1基因全长,并采用生物信息学方法进行氨基酸序列比对和进化分析。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析2种材料春化过程中BcVIL1的表达情况。构建亚细胞定位载体pEZS-NL-BcVIL1,利用亚细胞定位技术,分析BcVIL1基因在真核细胞中表达的位置。[结果]2种材料中BcVIL1基因序列基本一致,开放阅读框为1020bp,编码339个氨基酸。进化分析表明:BcVIL1基因与大白菜进化关系最近,同源性最高(99%)。在PC-175中,春化处理7d就可以诱导BcVIL1基因的表达,且在整个春化过程及春化之后都有较高的水平表达,而在‘CX-49’中,BcVIL1基因在春化过程中的表达与未春化处理相比无显著差异。亚细胞定位结果表明:BcVIL1主要在细胞核与细胞膜上表达。[结论]BcVIL1基因在春化过程中其表达具有品种特异性,且在不结球白菜中该基因主要在细胞核与细胞膜上发挥作用。
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