【目的】采用real-time PCR方法检测体外激素处理对奶牛乳腺上皮细胞FcRn(neonatal Fc receptor,FcRn)mRNA表达的影响。【方法】在乳腺上皮细胞培养液中添加不同浓度胰高血糖素(0.01、0.1和1μmol.L-1)、胰岛素(0.005、0.1和0.5μmol.L-1)、甲状腺素T4(0.01、0.1和1μmol.L-1),体外培养并收集细胞,提取细胞mRNA后,利用real-time PCR检测FcRn mRNA的相对丰度。【结果】在一定添加剂量范围内,随着添加剂量的增加,甲状腺素和胰高血糖素能够显著地促进FcRn mRNA表达量升高(P<0.05),胰岛素...

为阐明甲状腺素及胰高血糖素对高温体外培养奶牛乳腺上皮细胞内热休克蛋白(HSPs)mRNA转录和蛋白表达的影响。本试验对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞添加不同浓度的甲状腺素、胰高血糖素,分别于42℃培养12 h。采用RT-qPCR方法检测细胞内HSF-1、HSP27、HSP70和HSP90的mRNA表达丰度,ELISA方法检测HSP27、HSP70和HSP90的蛋白质表达。各浓度的甲状腺素、胰高血糖素均能显著降低高温条件下奶牛乳腺上皮细胞中HSP27、HSP70和HSP90 mRNA表达丰度(P<0.05);各浓度的胰高血糖素能极显著的降低高温条件下HSP27、HSP70和HSP90的蛋白表达(P<...

为分析苜蓿素对脂多糖诱导下体外培养奶牛乳腺上皮细胞抗炎和乳蛋白合成相关基因表达的影响,本研究将体外培养的奶牛乳腺上皮细胞分成4组,即基础培养基(对照)和基础培养基中分别加入1μg·m L-1LPS(L)、1μg·m L-1LPS+10μg·m L-1苜蓿素(L+T)和10μg·m L-1苜蓿素(T)。结果显示,1)与对照组相比,L组奶牛乳腺上皮细胞的活性显著下降(P<0.05),而T组则显著升高(P<0.01)。2)L+T组细胞的超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于L组(P<0.01),而一氧化氮(NO)

【目的】奶牛乳房炎是奶牛养殖业中最为常见,同时也是带来经济损失最为严重的疾病之一,其主要病因是细菌感染。奶牛乳腺的固有免疫是抵抗病原菌入侵的第一道防线。NOD2是机体固有免疫模式识别受体核苷酸结合寡聚域(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)蛋白家族中的重要一员,通过识别其特异性配体胞壁酰二肽(muramyl dipeptide,MDP)——一种广泛存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁中的成分,而参与抵抗多种病原菌入侵。奶牛乳腺上皮细胞(bovine

[目的]本文旨在了解瘦素(LEP)对牦牛乳腺上皮细胞(YMEC)中细胞信号转导抑制因子3(SOCS3)和信号传导及转录激活蛋白3(STAT3)蛋白表达的作用特点及催乳素(PRL)对LEP功能发挥可能产生的影响。[方法]以牦牛乳腺上皮细胞为载体，以添加和不添加催乳素(500 ng·mL~(-1))为前提，用不同剂量瘦素(0、50、100、200、400、800 ng·mL~(-1))作用YMEC 48 h以及添加JAK2/JAK3信号通路阻滞剂AG490作用48 h,采用Western blot技术检测SOCS3和STAT3蛋白的相对表达水平及STAT3蛋白磷酸化水平。[结果]无催乳素时，除50 ng·mL~(-1)瘦素外，其余各剂量均抑制SOCS3蛋白的表达，而各浓度LEP均抑制STAT3蛋白的表达，STAT3蛋白磷酸化水平高于蛋白表达水平。有催乳素时，SOCS3蛋白除了在100 ng·mL~(-1) LEP下被抑制之外，其余各剂量均有促进作用；800 ng·mL~(-1) LEP对STAT3蛋白表达有显著抑制作用，STAT3磷酸化水平除100 ng·mL~(-1)组外，均有所升高。添加AG490之后，SOCS3与STAT3都主要是通过JAK2激活诱导。[结论]高浓度瘦素会抑制SOCS3及STAT3蛋白的表达，瘦素主要通过JAK2/STAT3通路发挥生理功能，而SOCS3是JAK2/STAT3通路的负反馈调节因子；PRL能够缓解高浓度LEP导致的瘦素抵抗作用，并且能促进SOCS3和STAT3蛋白的表达。

[目的]本试验旨在探讨去乙酰化蛋白7(sirtuin 7,SIRT7)对奶牛乳腺上皮细胞(DCMEC)合成乳蛋白、乳脂和乳糖关键基因表达的影响。[方法]以体外原代培养的中国荷斯坦奶牛DCMEC为试验材料,纯化后转染质粒p CDNA3.1-SIRT7,继续培养48或72 h后收集细胞。采用RT-qPCR和Western blot法检测乳蛋白、乳脂和乳糖合成关键基因mRNA和蛋白的表达;通过特异性试剂盒检测胞内和培养基中甘油三脂(TG)含量。[结果]1)乳蛋白:与对照组相比,过表达SIRT7可显著提高αs1-酪蛋白基因(CSN1S1)、β-酪蛋白基因(CSN2)和ETS转录因子基因(ELF5) mRNA水平,促进CSN2蛋白合成,激活雷帕霉素靶蛋白(m TOR)磷酸化; 2)乳脂:与对照组相比,过表达SIRT7可显著提高乳脂合成关键因子过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)、固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1) mRNA和蛋白水平,显著增加细胞内甘油三酯(TG)含量; 3)乳糖:与对照组相比,过表达SIRT7可显著提高乳糖合成关键因子葡萄糖转运蛋白1(GLUT1) mRNA表达。[结论]在体外培养条件下,过表达SIRT7可促进DCMEC中乳蛋白、乳脂和乳糖合成关键基因的表达。

为了构建HSP72慢病毒表达载体,建立稳定表达HSP72的牛乳腺上皮细胞系。以牛HSP72基因序列为模板,设计并合成引物,PCR扩增目的基因,连接到慢病毒表达质粒中,用包装获得的慢病毒感染牛乳腺上皮细胞,经一定浓度的嘌呤霉素筛选,Hochest33342法对细胞核定位,倒置荧光显微镜下观察转染效率,用免疫组化和Western Blot方法验证感染细胞是否稳定表达HSP72。结果显示,携带HSP72基因的慢病毒滴度约为1. 0×109TU/m L;确定嘌呤霉素的最佳筛选浓度为2μg/m L;牛HSP72慢病毒感染细胞表达HSP72,感染的奶牛乳腺上皮细胞在倒置荧光显微镜下可看到绿色荧光,转染效率可达90%以上;免疫组化结果表明,正常细胞和空载体感染细胞,HSP72呈现低表达,转染携带HSP72目的基因载体细胞,HSP72高表达,呈现颜色较深的棕色; Western Blot方法检测证实与正常转染细胞相比,慢病毒空载体转染的奶牛乳腺上皮细胞HSP72表达稍有降低,但无统计学差异,而携带HSP72基因的慢病毒载体转染的细胞HSP72呈现高表达,且差异极显著(P

旨在探索不同浓度玉米赤霉烯酮(ZEN)对奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)生长和乳脂合成相关基因表达的影响。首先，用不同剂量ZEN处理MAC-T细胞36 h,血细胞计数板统计细胞数量，染色并分析细胞凋亡与坏死情况，筛选ZEN添加的合适剂量；接着，试剂盒检测ZEN对MAC-T细胞中活性氧(ROS)以及线粒体膜电位的影响；最后，利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术，分析ZEN对MAC-T细胞增殖、凋亡、氧化应激和乳脂合成相关基因表达的影响。结果表明，低剂量ZEN(0.01～1.00μmol/L)有促进MAC-T生长的趋势，而高剂量ZEN(5.00～10.00μmol/L)显著降低MAC-T细胞数量；0.10μmol/L ZEN对MAC-T中ROS和线粒体数量无明显影响，但10.00μmol/L ZEN显著增加了MAC-T中ROS水平，降低了线粒体数量；RT-qPCR结果表明，0.10μmol/L ZEN显著促进增殖基因(CDK1、CCND2)、抗氧化基因(DHODH、GPX4)和抗凋亡基因(BCL-2)表达，但同时提高了凋亡基因(CAS-3、BAX)表达量；10.00μmol/L ZEN显著抑制增殖基因(PCNA、CDK1、CCND2)、抗氧化基因(DHODH、GPX4、AIFM2)和抗凋亡基因(BCL-2)表达，但显著促进凋亡基因(CAS-3、BAX)表达；值得注意的是，0.10μmol/L ZEN显著促进了乳脂合成相关基因(PPARγ、FASN、JAK-2),但10.00μmol/L ZEN显著抑制了这些基因表达。上述结果提示，不同浓度ZEN对MAC-T细胞的作用存在差异：0.10μmol/L ZEN可以促进MAC-T细胞生长和乳脂合成相关基因表达的同时，也会诱导凋亡基因表达；10.00μmol/L ZEN会诱导MAC-T细胞氧化应激、降低线粒体数量，抑制增殖、抗氧化、抗凋亡和乳脂合成相关基因表达，同时促进凋亡基因表达，导致细胞死亡。

【目的】研究中药复方灌注液及其中的单味中药提取物对原代培养的奶牛乳腺上皮细胞增殖及总蛋白含量的影响。【方法】采用原代组织块贴壁法获得奶牛乳腺上皮细胞,以质量浓度为5,10,15和20mg/mL的中药复方灌注液以及紫花地丁、黄芪、泽兰、鸡血藤、诃子提取物,分别作用于对数生长期的奶牛乳腺上皮细胞,确定最适宜中药质量浓度,采用该质量浓度提取物处理对数生长期的乳腺上皮细胞,并分别在处理的1,3和5d时取样,采用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测细胞活性,并测定细胞分泌的总蛋白含量。【结果】通过组织块贴壁与胰蛋白酶消化法相结合,得到较纯化的奶牛乳腺上皮细胞。泽兰、鸡血藤、复方灌注液在质量浓度为10mg/m...

【目的】硒(Se)能否通过Nod2/MAPK/mTOR途径调控金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤,有待于进一步研究。因此本研究将探究硒对金黄色葡萄球菌(S. aureus)感染的奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)Nod2/MAPK/mTORs信号通路中关键蛋白表达的影响,从而为阐明硒的免疫调控机制提供理论依据。【方法】首先将bMECs以106细胞/孔接种于6孔板中,当细胞超过80%的汇合度时,用含2、4和8μmol·L~(-1)浓度硒的培养基替换原来的培养基,继续孵育12 h,然后用PBS洗涤每孔3次,将S. aureus按MOI=1:1的比例加入6孔板中,继续培养0.5 h,然后收集bMECs细胞进行相关蛋白的检测。本试验共分3大组,即对照(Con)组(bMECs)、模型(Mod)组(bMECs+S. aureus)和试验组。其中试验组又分3个亚剂量组,即Low组(bMECs+2μmol·L~(-1) Se+S. aureus)、Mid组(bMECs+4μmol·L~(-1) Se+S. aureus)和Hig组(bMECs+8μmol·L~(-1) Se+S. aureus),每组设3个重复。利用BCA蛋白测定试剂盒对收集的bMECs细胞进行总蛋白提取。应用Western blotting技术检测bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平。将蛋白样品加到10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中,上样量为20μg/孔,之后将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。将PVDF膜用5 mL 5%脱脂乳阻断2 h,脱脂乳脱脂后用TBST清洗后,分别用5 mL的Nod2、RIP2、JNK、AKT、mTOR和β-actin的一抗孵育过夜,回收一抗。之后在PVDF膜中分别加入5 mL上述蛋白的二抗,室温孵育2 h,回收二抗。PVDF用TBST洗涤5次,最后在暗室条件下进行化学显影。【结果】S. aureus能显著提高bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平(P<0.01)。在培养基里添加2μmol·L~(-1)的硒可极显著抑制Nod2蛋白的表达(P<0.01),在培养基里添加8μmol·L~(-1)的硒可显著抑制Nod2的表达(P<0.05),而在培养基里添加8μmol·L~(-1)硒可显著抑制RIP2蛋白的表达(P<0.01)。在培养基里添加4μmol·L~(-1)的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平(P<0.05),在培养基里添加8μmol·L~(-1)的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平(P<0.01)。在培养基里添加4μmol·L~(-1)硒可极显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平(P<0.01),在培养基里添加8μmol·L~(-1)硒可显著抑制AKT蛋白的磷酸化水平(P<0.01)。在培养基里分别添加4μmol·L~(-1)和8μmol·L~(-1)硒均能显著抑制mTOR蛋白磷酸化水平(P

【目的】探讨TGF-β1对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡和HSP70蛋白表达的影响。【方法】TGF-β1作用乳腺上皮细胞不同时间,收集细胞及培养液,应用MTT检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞凋亡率、比色法检测LDH活性、琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性、Western bolt技术分析HSP70蛋白的表达量。【结果】1、5、10ng·ml-1的TGF-β1均能抑制乳腺上皮细胞的增殖,且随浓度增加抑制作用加大,呈现剂量依赖性,其中10ng·ml-1TGF-β1组与对照组差异显著(P<0.05);10ng·ml-1TGF-β1作用于乳腺上皮细胞,随着作用时间的延长,细胞凋亡率逐渐升高,其中6、12和24...

【目的】MicroRNA(miRNA)是一类长度约21-23个核苷酸的非编码小RNA分子,本研究旨在分析高温条件下miRNA-24对乳腺上皮细胞生长、凋亡的作用及其初步机制。【方法】体外培养奶牛乳腺上皮细胞,高温(41℃)处理所培养的细胞;应用miRNA基因沉默技术,抑制高温处理过的乳腺上皮细胞中miRNA-24的表达;采用细胞计数法分析细胞增殖情况;Hoechst33342/PI荧光染色、流式细胞术检测miRNA-24对乳腺上皮细胞凋亡的作用,Western blot检测凋亡相关因子表达变化。【结果】抑制miRNA-24的表达,高温条件下的乳腺上皮细胞增殖能力显著增强(P<0.05),凋亡细...

[目的]本试验旨在揭示胆碱对热应激诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡的抑制作用。[方法]奶牛乳腺上皮细胞系(MAC-T细胞)于含10%胎牛血清的DMEM培养基中进行体外培养,将细胞分为对照组、胆碱组(100μmol·L~(-1))、热应激组(42℃,2 h)、热应激+胆碱组。采用CCK-8法分析添加胆碱对MAC-T细胞的药物毒性及细胞增殖活性的影响,采用Western blot分析蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)磷酸化水平及激活转录因子4(ATF-4)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)和Bcl-2关联X(Bax)蛋白表达水平,RT-qPCR检测GRP78、CHOP、ATF-4、Bax、Bcl-2、Caspase-3(胱氨酸蛋白3基因)mRNA水平。[结果]与对照组相比,热应激组MAC-T细胞的相对存活率极显著降低(P<0.01),p-PERK、ATF-4、CHOP、GRP78和Bax蛋白表达量极显著升高(P<0.01),Bcl-2表达量极显著下降(P<0.05),p-PERK、ATF-4、CHOP、GRP78和Bax蛋白表达量均极显著下降(P<0.01),Bcl-2蛋白表达量升高(P

【目的】探究苦参碱对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）增殖、凋亡及抗氧化能力的影响。【方法】利用含0（A组），25（B组），50（C组），75（D组）和100 μg/mL（E组）苦参碱的培养基培养奶牛乳腺上皮细胞。通过四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测BMECs活性，采用流式细胞仪（AnnexinV/PI双染法）检测苦参碱对BMECs凋亡的影响，并检测苦参碱对BMECs抗氧化酶活性及丙二醛（MDA）含量的影响，采用real-time PCR对BMECs中Caspase-3、p53、STAT1和SOCS3

在培养基中添加葡萄糖和甲状腺素(T3),观察鸡前脂肪细胞的生长及分化后的增殖情况及检测THRSPα基因在不同时间段的表达情况。结果表明,葡萄糖和甲状腺素(T3)的使用没有显著促进脂肪细胞数量的增长,各试验组在前3 d细胞数量保持一定幅度的增长,但低于对照组,第4天数量降幅很大,除200 nmol/L T3外其他3组在第5天稍有回升,组间差异不显著(P>0.05)。添加50 nmol/L T3和200 nmol/L T3的2个试验组THRSPα基因相对表达量在第2天有较大幅度的增加且差异极显著(P