【目的】开发一种可同时检测黄瓜靶斑病菌（Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ ＣａｓｓｉｉＣｏｌａ）、黄瓜炭疽病菌（ＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉＣｈｕｍ ｏｒｂｉＣｕｌａｒｅ）和黄瓜细菌性角斑病菌（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｌａＣｈｒｙｍａｎｓ）的三重ｐＣｒ快速检测方法。【方法】根据ｉｔｓ或１６ｓ ｒ ｄｎａ序列分别设计黄瓜靶斑病原菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌特异性检测引物；通过鉴定引物的特异性，筛选可在目标菌株中扩增出特异片段的特异引物；选择可以组合的３种病原菌特异性引物进行三重ｐＣｒ，对引物浓度、退火温度、延伸时间和循环数分别进行优化，优化三重ｐＣｒ体系。【结果】针对黄瓜靶斑病菌、．．．

采用黄瓜细菌性角斑病菌作为包被抗原,对反应条件进行优化,建立较优黄瓜细菌性角斑病菌间接酶联免疫吸附分析(ELISA)检测方法。通过对抗原包被浓度和抗体稀释浓度、封闭液和封闭时间、抗体温育时间等的优化,确定ELISA法最低检测限。结果表明:抗原的较优包被浓度为106cfu·mL-1,抗体的较优工作浓度为1∶4000,以5%胎牛血清作为封闭液,在37℃下封闭1.5h,加入抗体温育1.5h是间接ELISA法的较优反应条件,方法的检测限为105cfu·mL-1。对田间采集的病叶进行检测表明,该方法可准确检测出黄瓜细菌性角斑病菌,可用于田间黄瓜细菌性角斑病的快速诊断。

【目的】探索和优化检测条件,建立同时检测草莓灰霉病菌Botrytiscinerea,炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides和黄萎病菌Verticillium dahliae的三重PCR检测体系,为3种病害的早期快速诊断和鉴定提供技术和方法。【方法】选择可以组合的3种病原菌特异引物,研究多重PCR的影响因素,优化PCR退火温度,采用正交试验方法,以3个引物组、TaqDNA聚合酶、dNTP和Mg2+六因素三水平优化多重PCR体系。【结果】建立并验证适合上述草莓主要病原菌的三重PCR最佳检测体系,可分别扩增出729、539和450bp的特异条带,最适退火温度为50℃,2...

【目的】建立nested-PCR方法,快速检测西瓜种子中的燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli,Aac),为西瓜细菌性果斑病(bacterial fruit blotch of watermelon,WFB)的防控提供技术支持。【方法】根据Aac BOX短重复序列的PCR产物设计两对引物BX-L1/BX-R5和BX-L1/BX-S-R2,建立以BX-L1/BX-R5为外侧引物,BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR,以5μL样品处理液于99℃高温裂解10 min,再放置冰上冷却5 min,以所释放病原DNA为模板进行PCR扩增...

以黄瓜细菌性白枯病菌胞内蛋白为免疫原,制备抗体,建立黄瓜细菌性白枯病菌ELISA检测方法。结果表明:测定纯化后抗体的效价为1∶4000,与黄瓜细菌性角斑病菌等26个菌株无交叉反应,特异性强;方阵试验测定抗原的最佳包被浓度为107cfu.mL-1,抗体的工作浓度为1∶2000;优化ELISA检测条件,确定抗体4℃过夜包被效果最好,选择5%的胎牛血清作为抗体的封闭液,抗体的最佳封闭时间为1.5h,抗体的最佳孵育时间为1.5h,最佳底物作用时间为10min;建立ELISA标准工作曲线,表明抗体的灵敏度为105cfu.mL-1。ELISA检测田间采集的白枯病病叶显示,抗体可与病叶提取液发生特异性反应,...

选择西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli,Aac)的抗利福平菌株RifAac,通过人工模拟接种试验,采用选择性平板分离、菌落PCR(Bio-PCR)和常规PCR方法,观察该病原细菌在西瓜种子、土壤、病残体和田水中的存活期。结果表明,果斑病细菌在种子表面可存活4～5个月,在田水中可存活2个月,在不含植物残体的土壤中可存活8个月,在含西瓜残体的土壤中可以存活12个月以上。

【目的】哈密瓜细菌性果斑病在中国为新发生的病害,其病原菌为燕麦食酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.Citrulli),危害瓜果造成品质下降。该病为典型的种传细菌性病害,因此种子检疫成为防治此病害的重要手段。【方法】通过实验,将生物学、免疫学和分子生物学检测技术有机结合,建立了一套针对哈密瓜果斑病的种子带菌检测方法Bio-IMS-Real-timePCR。【结果】经过人工模拟种子带菌检测实验,结果表明该方法可成功地检测出1000粒种子中的1粒带菌种子(带菌量约为1.04×105CFU/种子,经计算,可以检测的最初浓度为2CFU·ml-1ASCM培养液),且信号较强。【...

黄瓜细菌性白枯病是黄瓜生产上的重要细菌病害,通过病菌16S rDNA序列测定、相关序列比对、系统进化树构建及特异性引物设计研究,明确该病菌系统进化关系,建立PCR检测方法。经NCBI-BLASTn结果表明:黄瓜细菌性白枯病菌CU-PV 07菌株的16S rDNA基因序列与GenBank中的同种相关序列存在较少碱基的差异,同源性达到了99%。设计的引物P1/P2具有很强的特异性,PCR扩增后只有该病菌呈阳性。构建的PCR检测体系检测准确、灵敏度高,可用于此病害快速诊断。

【目的】筛选出对细菌性果斑病菌具有较好抑制作用的药剂,利用细菌性果斑病菌PCR检测技术,预防病害通过带病种子种苗传播扩散,为广西西瓜甜瓜细菌性果斑病害综合防治提供技术支撑。【方法】采用PCR方法对样品进行检测,用抑菌圈法测定13种杀菌剂对广西甜瓜细菌性果斑病菌株(WM0922-3和XD0611-7)和西瓜细菌性果斑病菌株(XD0819-2)的抑制效果。【结果】2014-2017年,检测种子共计345份,其中葫芦种子203份,检出率为6.4%;南瓜种31份,检出率为9.68%;西瓜种子66份,检出率为4.55%;甜瓜种子45份,检出率为26.67%;送检西瓜嫁接苗65份,检出率为7.69%。检测田间疑似样品共计405份,其中西瓜样品187份,检出率为10.69%;厚皮甜瓜样品186份,检出率为6.99%;薄皮甜瓜样品32份,检出率为18.75%。1号杀菌剂对3个菌株的抑制效果均为最好,有效浓度中EC50均小于0.4×10~(-3)mg/L;其后依次为40%甲醛、72%农用硫酸链霉素可溶粉剂、80%乙蒜素乳油和64%杀毒矾可湿性粉剂,其中80%乙蒜素乳油和64%杀毒矾可湿性粉剂对XD0819-2的抑制效果优于WM0922-3和XD0611-7;硫酸链霉素和12%中生菌素母药对WM0922-3和XD0611-7具有较好抑制效果,但对XD0819-2无抑制作用。47%加瑞农可湿性粉剂、30%琥胶肥酸铜可湿性粉剂、20%吗胍·乙酸铜可湿性粉剂、46%氢氧化铜水分散粒剂、20%噻菌铜悬浮剂和2%春雷霉素水剂对3个菌株均无抑制作用。【结论】广西市售的西瓜甜瓜种子、种苗和田间样品均检测到细菌性果斑病菌,因此,应加强西瓜甜瓜种子种苗检疫管理,杜绝带病种子种苗传播病害。在生产中,建议使用1号杀菌剂和40%甲醛药剂进行种子消毒处理。

从土壤中分离得到的120个菌株中,筛选出对黄瓜角斑病菌有较强抑菌活性的拮抗细菌B9。温室盆栽防治试验结果表明:该菌株显著抑制角斑病的发生,防治效果达72.1%;拮抗细菌B9在28℃、pH值7.0生长最好,培养60h时,其OD值可达到1.708。经初步鉴定,该拮抗菌株属于黄杆菌属(Flavobacteriumsp.)。

利用通用引物扩增了玉米细菌性枯萎病菌及其近似种的转录间隔区并进行了序列测定。通过序列比较,设计了一对玉米细菌性枯萎病菌的专化性引物,并对所有参试菌株进行扩增。结果显示:该对引物能从参试的玉米细菌性枯萎病菌中特异性地扩增出1条299bp的条带,而其他参试菌株没有扩增信号。与扩增细菌ITS区域的通用引物结合使用,建立了检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌的巢式PCR技术,其检测灵敏度可达到4个细菌细胞,可以准确、灵敏地检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌。

【目的】探索西瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)的分子检测技术,为西瓜、甜瓜等生长期和采后炭疽病的快速、准确鉴定和检测提供技术和方法。【方法】根据GeneBank中Colletotrichum属的24个种ITS序列,比较设计出1对引物CY1/CY2(CY1:5′-CTTTGTGAACATACCTAACC-3′;CY2:5′-GGTTTTACGGCAGGAGTG-3′);进一步利用RAPD随机引物扩增西瓜炭疽菌C.orbiculare和菜豆炭疽菌C.lindemuthianum,找出在C.orbiculare中的特异性条带,经过克隆、测序后,设计出1对SCAR引物R...

【目的】由大斑突脐蠕孢(Exserohilum turcicum)和玉蜀黍平脐蠕孢(Bipolaris maydis)引起的玉米大斑病和小斑病是玉米生产上重要的叶部真菌病害,本研究旨在建立玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法,为玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型田间分布和有性生殖研究提供技术方法。【方法】根据GenBank中已登录的玉米大斑病菌(登录号MAT1-1:GU997138和MAT1-2:GU997137)和小斑病菌(登录号MAT1-1:X68399和MAT1-2:X68398)交配型基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计2种病原菌交配型多重PCR检测特异性引物,采用单因素法对引物的退火温度以及扩增程序中延伸时间和循环数等重要参数进行优化,建立玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法,并对2种病原菌的交配型多重PCR检测灵敏度和特异性进行检验。同时,对田间采集的129株玉米大斑病菌和194株玉米小斑病菌单孢菌株的交配型进行多重PCR检测,以明确建立的交配型多重PCR检测方法的适用性。【结果】建立的多重PCR方法和设计的交配型特异引物StMAT01-2F/R、StMAT02-3F/R、ChMAT01-3F/R和ChMAT02-2F/R可分别扩增出MAT1-1、MAT1-2型菌株大小为816、132 bp(大病斑菌)与490、136 bp(小病斑菌)的特异性目的条带。25μL多重PCR扩增体系:2×Multiplex PCR Mix 12.5μL,引物各10 pmol,DNA模板100 ng,退火温度为57.2℃(大病斑菌)和55.0℃(小斑病菌),35个循环。该多重PCR对玉米大斑病菌MAT1-1、MAT1-2型单孢菌株的检测灵敏度分别为0.1、0.01 ng基因组DNA,而对玉米小斑病菌MAT1-1、MAT1-2交配型的检测灵敏度均为0.1 ng基因组DNA。该交配型多重PCR检测方法对玉米大斑病菌和小斑病菌特异性很强,能够很好地区分玉米大斑病菌和小斑病菌相应的近缘种和14株其他真菌菌株。不同地理来源的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型检测结果表明,该多重PCR能够准确地检出129株玉米大斑病菌和194株玉米小斑病菌的交配型,且检测结果与随机抽取的菌株杂交验证结果完全吻合。【结论】构建的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法灵敏度高、特异性好、操作简便,能够准确、快速地检测出玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型,为玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型田间分布和监测及有性生殖研究提供了可靠的技术方法。

【目的】西瓜细菌性果斑病由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac)引起,是一种严重的世界性病害。细菌的鞭毛通常被认为是细菌的运动器官,在细菌的侵染过程中也起重要作用,已有报道表明这种作用可受鞭毛蛋白基因fliS的调控,目前西瓜细菌性果斑病菌鞭毛蛋白基因fliS的功能及其调控机理尚不清楚,本研究旨在探讨该基因在鞭毛形成和致病性等生物学特性中的作用。【方法】以果斑病菌野生型致病菌株1号基因组DNA为模板,设计一系列引物,PCR扩增敲除基因fliS的上下游片段,通过回收、酶切、连接、转化等步骤

[目的]建立水稻叶鞘网斑病的快速PCR检测体系,为该病害的早期诊断提供技术支持。[方法]以水稻叶鞘网斑病病原菌帚梗柱孢霉(Cylindrocladium scoparium Morgan)DNA为模板,分别以factor 1-α(tef1)和β-tubulin gene两个保守性极强的特定区域序列作为检测靶标,针对C.scoparium设计了EF-S-4/EF-A-4和BT-S-9/BT-A-9两对特异性引物,建立了水稻叶鞘网斑病的双基因联合PCR检测技术。[结果]该体系的最佳退火温度为58℃,DNA灵敏度检测限达到550 fg·μL-1,病原菌可扩增出大小分别为272 bp和157 bp的2...