【目的】探索和优化检测条件,建立同时检测草莓灰霉病菌Botrytiscinerea,炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides和黄萎病菌Verticillium dahliae的三重PCR检测体系,为3种病害的早期快速诊断和鉴定提供技术和方法。【方法】选择可以组合的3种病原菌特异引物,研究多重PCR的影响因素,优化PCR退火温度,采用正交试验方法,以3个引物组、TaqDNA聚合酶、dNTP和Mg2+六因素三水平优化多重PCR体系。【结果】建立并验证适合上述草莓主要病原菌的三重PCR最佳检测体系,可分别扩增出729、539和450bp的特异条带,最适退火温度为50℃,2...

【目的】开发一种可同时检测黄瓜靶斑病菌（Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ ＣａｓｓｉｉＣｏｌａ）、黄瓜炭疽病菌（ＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉＣｈｕｍ ｏｒｂｉＣｕｌａｒｅ）和黄瓜细菌性角斑病菌（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｌａＣｈｒｙｍａｎｓ）的三重ｐＣｒ快速检测方法。【方法】根据ｉｔｓ或１６ｓ ｒ ｄｎａ序列分别设计黄瓜靶斑病原菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌特异性检测引物；通过鉴定引物的特异性，筛选可在目标菌株中扩增出特异片段的特异引物；选择可以组合的３种病原菌特异性引物进行三重ｐＣｒ，对引物浓度、退火温度、延伸时间和循环数分别进行优化，优化三重ｐＣｒ体系。【结果】针对黄瓜靶斑病菌、．．．

【目的】灰霉病是草莓生产过程中的一种重要病害,严重影响了其产量和品质。论文旨在明确四川省草莓灰霉病菌对咯菌腈的抗性频率以及抗性机制,为草莓灰霉病的药剂防治提供理论依据。【方法】2016—2017年从四川成都、德阳、眉山、乐山及雅安等地采集草莓灰霉病样本,并分离纯化得到188株草莓灰霉病菌菌株。采用区分计量法测定188株灰霉病菌对咯菌腈的敏感性水平,采用菌丝生长速率抑制法测定咯菌腈对代表性菌株的毒力和渗透压敏感性,采用甘油铜比色法测定经咯菌腈处理的抗性菌株和敏感菌株甘油含量,采用分段测序对抗性菌株和敏感菌株Ⅲ型组氨酸激酶基因BOS1(BC1G_00374)扩增测序,采用Swissmodle和I-TASSER预测和评价突变对BOS1的结构影响。【结果】188株灰霉病菌菌株中有8株表现为高抗,9株为中抗,43株为低抗,其余表现为敏感;咯菌腈对代表性菌株的EC50介于0.03—0.62μg·mL~(-1),代表性菌株的抗性倍数范围为2.2—45.9。NaCl浓度在1.25—10 g·L~(-1)可刺激敏感菌株生长,浓度在1.25—20 g·L~(-1)范围可刺激抗性菌株生长,但>40 g·L~(-1)时则抑制菌丝生长,尤其对抗性菌株,抗性越高抑制作用越强;在正常条件下各代表性菌株甘油含量介于0.0025—0.0148μg·mL~(-1),且菌株的甘油含量与咯菌腈抗性没有明显的关联性,但在使用咯菌腈处理(0.1μg·mL~(-1))抗性菌株和敏感菌株后,甘油含量均上升,且抗性菌株甘油含量上升幅度明显低于敏感菌株。低抗菌株YAHY-13、CDCZ-2以及中抗菌株CDCZ-42在TAR和HAMP区域均发生突变,中抗菌株CDCZ-20和高抗菌株MYFC-10、CDCZ-43在TAR和REC区域均有突变,但CDCZ-20菌株在TAR区域位点是I365N,而两株高抗菌株在TAR区域位点是I365S。不同突变位置对BOS1区域结构有不同程度的影响,其中F127S、I365N、I365S、V1136I、A1259T均处于BOS1区域结构的无规则卷曲,但TAR区域I365N和I365S使区域结构无规则卷曲发生整体偏移。【结论】四川省已有部分地区草莓灰霉病菌对咯菌腈产生了抗性;相比敏感菌株,田间抗性菌株对渗透压的耐受能力增加,但当浓度超过耐受范围后对渗透胁迫高度敏感,药剂胁迫下田间抗性菌株甘油含量增加量显著小于敏感菌株;组氨酸激酶BOS1突变的位置和方式与灰霉病菌菌株对咯菌腈的抗性水平存在必然联系。

【目的】建立在鸡肉生产一线具有较强操作性,并可同时检测沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157的三重PCR方法。【方法】利用该3种致病菌的特异性基因invA、HlyA、rfbE设计3对引物,在确定方法特异性和抗干扰能力的基础上,用优化后的反应体系对反应灵敏度进行测定,模拟并检测在鸡肉中常见腐败菌和鸡肉基质对检测方法的干扰影响作用下,在前增菌程序的辅助下该方法的实际样品检测灵敏度。【结果】该方法特异性和抗干扰能力强,3种致病菌测序结果的同源性分别达到100%、99%和99%,反应体系的最佳退火温度为51℃,灵敏度试验中3种致病菌同时检出的检测线达到103CFU/mL,单重的灵敏度达到101CFU...

从天津市茄子保护地中分离出１２２个茄子灰霉病菌株中，多菌灵的抗性菌占４１０％，且多为高抗菌株；多菌灵与乙霉威间表现负交互抗性关系；速克灵和扑海因的抗性菌比率为２７９％，均为低抗水平，ＥＣ５０为２３０１１２０３８１０μｇ／ｍＬ，两种药剂存在交互抗性；对多菌灵、速克灵、扑海因均有抗性的菌株占供试菌株的２７９％，均敏感的菌株占５９０％，对多菌灵有抗性而对速克灵和扑海因敏感的菌株只占１３１％。

通过筛选特异性引物,优化多重PCR体系中的Mg2+、d NTP Mixture、Taq DNA聚合酶浓度,退火温度等反应条件,建立了多重PCR同时检测4种病菌(烟草黑胫病菌、根黑腐病菌、猝倒病菌和立枯病菌)的技术体系,得到265、364、400和541 bp共4条特异性条带,对应的病菌分别为猝倒病菌、黑胫病菌、根黑腐病菌、立枯病菌.该检测体系的灵敏度可达10-2ng·μL-1基因组DNA.

【目的】探索西瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)的分子检测技术,为西瓜、甜瓜等生长期和采后炭疽病的快速、准确鉴定和检测提供技术和方法。【方法】根据GeneBank中Colletotrichum属的24个种ITS序列,比较设计出1对引物CY1/CY2(CY1:5′-CTTTGTGAACATACCTAACC-3′;CY2:5′-GGTTTTACGGCAGGAGTG-3′);进一步利用RAPD随机引物扩增西瓜炭疽菌C.orbiculare和菜豆炭疽菌C.lindemuthianum,找出在C.orbiculare中的特异性条带,经过克隆、测序后,设计出1对SCAR引物R...

棉花黄萎病菌 (大丽轮枝菌 VD8)培养液中产生的毒素经纯化后获得电泳纯毒素PLPs,制备PLPs的抗血清 ,建立了检测棉花黄萎病菌毒素的间接ELISA方法。研究结果显示 ,PLPs抗血清的效价为 1∶10 2 40 0 ,最低检测量为 1 5 6ng。间接ELISA法检测显示 ,PLPs的免疫抗血清可以与多种棉花黄萎病菌菌株体外培养液 ,带菌棉籽的培养液 ,以及病棉的叶脉、叶柄及茎杆的榨取液发生特异性的反应 ,而与其他致病菌的培养液 ,健康棉籽的培养液以及健康棉株组织榨取液的反应呈阴性。由此可推知大丽轮枝菌的存在与否。

【目的】利用酶标仪建立番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)对杀菌剂敏感性的快速、高效测定方法。【方法】以OD增加值作为评价指标,确立微孔板法检测灰霉病菌敏感性的测试条件,并对啶酰菌胺、嘧菌酯、乙霉威、甲基硫菌灵、异菌脲、苯醚甲环唑6种常用杀菌剂对灰霉病菌孢子萌发和菌丝生长的抑制效果进行评价,将结果与孢子萌发法和菌丝生长速率法所得结论进行比对。【结果】微孔板法测定条件为:酶标仪测定波长为630nm,测试培养基为灰霉分生孢子萌发刺激液(PDE),孢子悬浮液浓度为8×105—1.6×106个/mL,培养条件为21℃黑暗条件下振荡(150 r/min),孔中加入孢子悬浮液与药剂培养24 h...

根据在GenBank已登录的萎蔫短小杆菌 (Curtobacterium flaccumfaciens)的基因间重复序列 ,用DNAman 5 0软件比较同源性 ,设计了一对引物CffF1和CffR2 ,并以菜豆萎蔫病菌的基因组DNA为模板进行扩增 ,得到了一段长 2 80bp的PCR特异产物。参试的其他属如棒形细菌属 (Clavibacter)、节杆菌属 (Arthrobacter)、拉氏杆菌属 (Rathayibac ter)、红球菌属 (Rhodococcus)细菌和萎蔫短小杆菌的其他致病变种 (Cur f pv oortii、Cur f pv poinsettiae、Cur f pv...

采用自行设计的、能对镰刀菌18srDNA进行特异性扩增的1对引物,利用PCR-RFLP对尖孢镰刀菌以不同方式侵染的植株进行跟踪检测。结果表明,应用PCR-RFLP检测程序可检测出处于侵染初期和潜育期的枯萎病菌,说明PCR-RFLP能够快速、灵敏、准确地对枯萎病进行早期诊断。

【目的】检测中国葡萄灰霉病菌对苯胺基嘧啶类杀菌剂嘧霉胺的抗药性,明确中国不同葡萄产区灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性及抗性频率,为葡萄灰霉病的药剂防治提供理论基础。【方法】从中国葡萄主产区采集、分离纯化104个葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.)的单孢菌株,采用菌丝生长速率法测定其对嘧霉胺的抗药性。【结果】中国葡萄灰霉病菌对嘧霉胺的抗性频率为22.22%—62.5%,且以高抗和中抗菌株为主,其中高抗菌株频率达44.23%;葡萄不同气候栽培区的灰霉病菌对嘧霉胺抗药性不同。【结论】中国葡萄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性较为普遍,且存在交互抗性,据此,在葡萄灰霉病的防治中应限制嘧霉胺的使用...

[目的]利用敏感性基线、交互抗性、生物适合度等评价新药的抗药性风险水平。本研究评价了灰霉病菌对氟吡菌酰胺的抗药性风险水平,这对科学使用氟吡菌酰胺和可持续防治灰霉病具有重要意义。[方法]采用菌丝生长速率法,测定了100株江苏省草莓灰霉病菌对氟吡菌酰胺的毒力曲线,建立了敏感性基线,并通过交互抗性及相关生物学测定,评价了其潜在的抗性风险。[结果]建立的敏感性基线是一个单峰曲线,接近正态分布,平均EC50为(1.94±1.55)μg·m L-1;氟吡菌酰胺与其同类的啶酰菌胺及其他类型杀菌剂之间不存在交互抗性;氟吡菌酰胺抗性菌株的生物适合度显著低于敏感菌株。[结论]灰霉病菌对氟吡菌酰胺的抗性风险属于低至...

【目的】利用双重PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌(Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus)和黑胫病菌(Pectobacterium atroseptica)。【方法】根据GenBank上发表的马铃薯环腐病菌pCS1质粒上纤维素酶A基因序列,对比近缘种及马铃薯上几种重要病原菌的核苷酸序列,设计并合成了1对特异性引物CMS1/CMS2,将设计的引物与已发表的PCR检测马铃薯黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r结合,经过条件优化后,建立了双重PCR体系。【结果】利用引物CMS1/CMS2扩增出了1条913 bp的马铃薯环腐病菌特异性条带。检测灵敏度...

草莓灰霉病菌(Botrytis Ciennea Persoon)在 21～25℃下 pH 3～4的霉菌生长培养基中培养产生毒素,致使草莓愈伤组织细胞的活性丧失。产生毒素的高峰期在静置培养20 d,培养滤液用氯仿萃取,所得粗提物稀释90倍后仍有毒性存在,30倍稀释的毒素溶液处理愈伤组织,用荧光法观察,1.0h细胞致死率达86％,2.5 h细胞致死率高达99.9％。