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[期刊] 水产学报
[作者]
龙凯 孙瑜 李艳红 腾树君 吴正理
钙调神经磷酸酶(CN)属苏/丝氨酸蛋白磷酸酶，在软体动物的抗菌应答、免疫调节中发挥重要作用。本研究利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆获得三角帆蚌CN基因α型催化亚基（HcCnAα）的c DNA序列，并进行了生物信息学分析。构建pET30aHcCnAα原核表达载体，将诱导表达、纯化、复性后蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。用蛋白质印迹法（Western blot,WB）和荧光定量PCR (qPCR)技术分析健康状态和感染维氏气单胞菌GL2后HcCnAα在三角帆蚌不同组织中的表达情况。结果显示，HcCnAαcDNA全长2 737 bp，其中3′UTR长131 bp,5′UTR长1 154 bp,CDS区为1 452 bp，编码483个氨基酸，序列包含蛋白磷酸酶保守的PP2Ac结构域。WB和qPCR结果显示，HcCnAα在三角帆蚌各组织中广泛存在，并在闭壳肌、斧足、性腺、鳃中的表达量较高，在血液中的表达量最低。维氏气单胞菌GL2感染三角帆蚌后3～24 h，鳃中HcCnAα的表达量显著升高，6 h时闭壳肌中表达量也显著升高，感染后24 h，肝胰腺、斧足、血液、外套膜中的表达量显著升高。而感染后48 h，闭壳肌、鳃、外套膜、肝胰腺中的表达量显著降低。研究表明，三角帆蚌HcCnAα基因与其他物种CnAα基因高度相似，具有保守的PP2Ac结构域，在各组织中普遍表达，并参与了三角帆蚌在细菌感染后的免疫反应。本研究首次克隆了三角帆蚌HcCnAα基因并制备了多克隆抗体，揭示了HcCnAα基因参与三角帆蚌的抗感染免疫应答，为深入研究三角帆蚌的免疫调控机制和疾病防控策略奠定了基础。
[期刊] 水产学报
[作者]
罗红瑞 白志毅 刘晓军 李清清 董绍建 曾仕梅 李家乐
为寻找珍珠层颜色形成相关基因,以转录组文库中标注的序列为模板,利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)方法,获得了三角帆蚌HcCUBDC基因的全长cDNA序列,共5 158 bp,开放阅读框(ORF)1 920 bp,编码639个氨基酸,5'端非编码区576 bp,3'端非编码区2 662 bp,Gen Bank登录号为KP067952。生物信息学分析表明,三角帆蚌HcCUBDC蛋白含有一个由19个氨基酸组成的信号肽和4个CUB结构域,但未能比对上已知的蛋白。经荧光定量PCR检测,HcCUBDC基因在紫色和白色蚌前端缘膜、后端缘膜、...
[期刊] 水产学报
[作者]
罗红瑞 白志毅 刘晓军 李清清 董绍建 曾仕梅 李家乐
为寻找珍珠层颜色形成相关基因，以转录组文库中标注的序列为模板，利用ｃＤＮＡ末端快速扩增（ｒＡｐｉＤ ＡｍｐｌｉｆｉｃＡｔｉｏＮ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅＮＤｓ，ｒＡｃｅ）方法，获得了三角帆蚌ＨｃｃＵＢＤｃ基因的全长ｃＤＮＡ序列，共５ １５８ Ｂｐ，开放阅读框（ｏｒｆ）１ ９２０ Ｂｐ，编码６３９个氨基酸，５＇端非编码区５７６ Ｂｐ，３＇端非编码区２ ６６２ Ｂｐ，ＧｅＮ ＢＡＮｋ登录号为ｋｐ０６７９５２。生物信息学分析表明，三角帆蚌ＨｃｃＵＢＤｃ蛋白含有一个由１９个氨基酸组成的信号肽和４个ｃＵＢ结构域，但未能比对上已知的蛋白。经荧光定量ｐｃｒ检测，ＨｃｃＵＢＤｃ基因在紫色和白色蚌前端缘膜、后端缘膜、．．．
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
刘斐斐 崔晓羽 董赛赛 段胜华 汪桂玲 李家乐
为进一步了解WNT4在三角帆蚌性别决定过程中的作用，通过RACE（Rapid-amplification of cDNA ends）技术克隆获得了三角帆蚌WNT4基因的全长cDNA，共1560 bp，其中5’-UTR 396 bp、3’-UTR 24 bp，开放阅读框（ORF）为1140 bp，可以编码379个氨基酸，且该序列含有Wnt家族特有结构域。对WNT4的氨基酸序列进行同源性分析后，发现该基因在物种间的进化关系和结构功能具保守性。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析发现WNT4基因在三角帆蚌雌雄多个组织中(外套膜、闭壳肌、鳃、性腺、斧足和肝)均有表达，表明其参与了多样的生物学过程，在腮、斧足、肝中表达量较高，在性腺、闭壳肌、斧足中雌雄间有显著性差异，且雌性三角帆蚌的性腺、闭壳肌表达量显著高于雄性。原位杂交结果显示，WNT4在雌性三角帆蚌的卵母细胞上有明显的杂交信号，推测WNT4基因与性别决定相关。
[期刊] 水产学报
[作者]
袁一鸣 李西雷 白志毅 汪桂玲 李家乐
采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)首次克隆了三角帆蚌过氧化氢酶(CAT)基因的cDNA全长序列,为2 804 bp,包含112 bp的5'非翻译区(untranslated region,UTR),1 303 bp的3'UTR和1 388 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)。ORF区共编码462个氨基酸,推算的分子量约为52.7 ku,理论等电点为6.35。多序列比对结果显示,有一段CAT氨基酸高度保守的催化位点序列FDRERIPERVVHAKGAG。三角帆蚌CAT基因有12个与...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
孔祎頔 田佳鑫 赵林辉 陈秀梅 单晓枫 王桂芹
【目的】克隆维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)低钙反应蛋白(AcrV)并进行原核表达,为进一步研究AcrV蛋白的结构功能及AcrV基因工程亚单位疫苗的制备奠定基础。【方法】克隆维氏气单胞菌TH0426菌株AcrV基因,通过生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、二级结构及三级结构。将AcrV基因克隆到pET-30a(+)原核表达载体上,构建原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,进行EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切鉴定和测序鉴定。用IPTG对pET-30a(+)-AcrV进行诱导表达,对IPTG浓度(0.2,0.4,0.6和0.8 mmol/L)和诱导时间(2,3,4和5 h)进行优化。在最佳条件下诱导表达重组蛋白AcrV,经镍柱纯化且尿素梯度复性后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,进行SDS-PAGE及Western blot分析,对目的蛋白的免疫原性进行检测。【结果】成功获得了1 086 bp的AcrV全基因,编码361个氨基酸。AcrV蛋白是无跨膜结构且不编码信号肽的蛋白,有2个高度保守的结构功能域,属于全α型蛋白。成功构建了原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV,其最佳诱导表达条件为IPTG 0.8 mmol/L诱导5 h。SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,AcrV蛋白能被鼠抗阳性血清识别,表明其具有一定的反应原性。【结论】成功克隆了1 086 bp的AcrV基因,分析了其编码蛋白的生物信息;获得了免疫原性良好的重组AcrV蛋白。
[期刊] 水产学报
[作者]
祁晓翔 李文娟 尚朝 周子睿 尚攀 施志仪
为了发掘更多三角帆蚌具有ＥＦ－ｈａｎｄ结构域的功能基因及其蛋白质，本研究运用ＲａＣＥ－ＰＣＲ技术，克隆得到了三角帆蚌包含ＥＦ－ｈａｎｄ结构域钙结合蛋白１基因（ＥＦ－ｈａｎｄ ＣａｌＣｉｕｍ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ－Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＰＲｏｔＥｉｎ １，ＥＦＣｂ１）的Ｃ ｄｎａ全长并进行了生物信息学分析；通过ＲＥａｌ－ｔｉｍＥ Ｑ－ＰＣＲ技术，分析了ＥＦＣｂ１基因在三角帆蚌１０个组织，以及内脏团、外套膜插核后不同时间点的时空表达特点。结果表明三角帆蚌ＥＦＣｂ１基因Ｃ ｄｎａ序列全长９８１ ｂＰ，ｏＲＦ为５３１ ｂＰ，编码１７６个氨基酸残基，５＇－ｕｔＲ ２３９ ｂＰ和３＇－ｕｔＲ ２１．．．
[期刊] 水产学报
[作者]
李西雷 李卿青 任名栋 白志毅 李家乐
清道夫受体(SR)是一类对化学修饰的脂蛋白具有很强结合活性的糖蛋白家族。本研究通过RACE方法克隆得到三角帆蚌hcSRCR1基因cDNA序列,该序列全长1 000 bp,其中开放阅读框819 bp,编码272个氨基酸,预测分子量为28.16 ku,理论等电点为5.55;预测含有2个SRCR结构域和6个保守的半胱氨酸残基。qRT-PCR和Western blot结果显示,hcSRCR1 mRNA和蛋白表达模式基本相同,均在三角帆蚌外套膜中表达量最高,在其他组织中的表达量普遍较低,且在紫色选育系外套膜组织中的表达量显著高于白色选育系。外套膜原位杂交结果显示,hcSRCR1基因主要在外套膜外褶的内、外上皮细胞层以及腹膜处的上皮细胞层中表达。研究表明,三角帆蚌hcSRCR1基因与贝壳珍珠质颜色形成具有一定相关性,可为进一步研究该基因在珍珠颜色形成过程中的调控机理提供基础资料。
[期刊] 水产学报
[作者]
祁晓翔 李文娟 尚朝 周子睿 尚攀 施志仪
为了发掘更多三角帆蚌具有EF-hand结构域的功能基因及其蛋白质,本研究运用RACE-PCR技术,克隆得到了三角帆蚌包含EF-hand结构域钙结合蛋白1基因(EF-hand calcium-binding domain-containing protein 1,EFCB1)的c DNA全长并进行了生物信息学分析;通过real-time Q-PCR技术,分析了EFCB1基因在三角帆蚌10个组织,以及内脏团、外套膜插核后不同时间点的时空表达特点。结果表明三角帆蚌EFCB1基因c DNA序列全长981 bp,ORF为531 bp,编码176个氨基酸残基,5'-UTR 239 bp和3'-UTR 21...
[期刊] 水产学报
[作者]
袁一鸣 李家乐 汪桂玲 白志毅 李西雷
采用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了三角帆蚌β-肌动蛋白基因的cDNA全序列,该序列全长为1483bp,由长92bp的5′非翻译区(untranslated region,UTR),257bp的3′非翻译区,和1134bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)组成。阅读框共编码377个氨基酸,推算的分子量约为41.9ku,理论等电点为5.3。三角帆蚌β-actin氨基酸序列中Met178,Ser305,Ser321,Pro325,Val331,Pro346等6个氨基酸残基具有特异...
[期刊] 水产学报
[作者]
施志仪 杨显祥 陈晓武 李勇
alpha-2巨球蛋白是河蚌体内重要的天然免疫因子,参与广泛的免疫防御和调节。通过RACE法克隆了三角帆蚌α2M全长cDNA序列,提交Genbank,获得核苷酸序列登陆号:DQ993157.1。同时,采用生物信息学方法对alpha-2巨球蛋白进行了系统分析。该基因cDNA全长5124bp,其中编码区4836bp,5′端非编码区35bp,3′端非编码区为253bp(含polyA尾31bp),该基因能编码1611个氨基酸,其中前23个氨基酸残基为信号肽序列,成熟蛋白分子量为177571.8u,等电点为5.49。蛋白的不稳定系数为39.53,表明该蛋白是稳定的。在此基础上,以18S作为内标,利用半定...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
刘佳敏 李文娟 施志仪 曹玉香 陆阿利
珍珠贝细胞体外培养存在细胞分裂迟缓问题，目前调控机制尚不清楚，制约了珍珠培育新工艺的发展。本研究通过现代分子生物学技术，从三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)中克隆了细胞周期蛋白B（cyclin B）基因的cDNA，得到长度为1024 bp的序列信息，包括768 bp的ORF，197 bp的3’-UTR，编码255个Aa。进一步分析表明，三角帆蚌cyclin B基因与牡蛎、扇贝具有较高的相似性，其氨基酸序列中具有一个典型的周期蛋白框（cyclin-box），并存在2个周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK）的作用位点。通过RT-Q PCR研究显示，三角帆蚌cyclin B基因在性腺中的表达最高，且cyclin B基因在雌性中的表达量显著高于雄性（P0.05）；沉默cyclin B基因后，除外套膜，其在性腺和鳃的表达显著降低（P
[期刊] 水产学报
[作者]
颜玲 钟婧妍 袁永斌 张瑶 胡宏辉 陆婷婷 白志毅
为了阐明谷胱甘肽硫转移酶Pi类基因(HcGSTP1)在三角帆蚌类胡萝卜素转运中的作用，并探讨该基因表达与三角帆蚌壳色的相关性。本实验克隆并鉴定了三角帆蚌HcGSTP1基因，对其进行了序列特征和进化分析，通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)和原位杂交(ISH)技术检测了HcGSTP1基因在三角帆蚌中的表达及定位情况，利用RNAi技术对其功能及作用机制进行了初步分析。结果显示，HcGSTP1基因的全长cDNA序列为1 317bp，其中开放阅读框(ORF)区为618 bp，编码205个氨基酸，包含一个GST-N-pi结构域和GST-C-Pi结构域。qRT-PCR结果显示，HcGSTP1基因在紫蚌肝胰腺和斧足中表达量极显著高于白蚌，且在紫蚌边缘膜和中央膜中表达量显著高于白蚌。原位杂交结果显示，HcGSTP1基因在外套膜的外褶、背膜区、腹膜区、部分中褶以及外褶与中褶连接处出现明显的阳性信号。RNAi技术结果显示，HcGSTP1基因在边缘膜中表达的干扰率达83.74%，同时发现边缘膜中总类胡萝卜素含量(TCC)降低了30.12%。上述实验结果初步证实HcGSTP1基因参与三角帆蚌类胡萝卜素的转运，进而可能会影响贝壳及珍珠呈色，为深入理解三角帆蚌类胡萝卜素转运及贝壳和珍珠颜色形成机制补充了分子依据。
[期刊] 水产学报
[作者]
王俊南 汪桂玲 白志毅 李家乐
为了探究ＲＡＣＫ１基因在三角帆蚌免疫系统中的调控机制，采用ＲＡＣＥ技术克隆得到三角帆蚌ＲＡＣＫ１基因（命名为ＨＣＲＡＣＫ１）的Ｃ ＤＮＡ全序列，并对该序列进行分析。结果显示，ＨＣＲＡＣＫ１基因全长为１２４９ ｂｐ，其中开放阅读框９５７ ｂｐ，编码３１８个氨基酸。蛋白质结构域分析显示ＨＣＲＡＣＫ１含有ＲＡＣＫ１家族特有的７个ＷＤ４０结构域。运用荧光定量ｐＣＲ技术分析ＨＣＲＡＣＫ１在正常组织中及受到嗜水气单胞菌侵染和重金属镉暴露后相关组织表达量的变化。结果显示，ＨＣＲＡＣＫ１在各个组织中均有表达，其中闭壳肌中表达量最高；嗜水气单胞菌侵染后，ＨＣＲＡＣＫ１在血淋巴中的表达量逐渐上升，２４ Ｈ时达到峰．．．
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
董姝君 汪桂玲 白志毅 李家乐
以三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)为研究材料,根据实验室构建的三角帆蚌cDNA文库中已标注的EST序列,利用RACE克隆了三角帆蚌AMP基因的cDNA全序列。该cDNA序列全长为970 bp,5′端非翻译区123 bp,3′端非翻译区526 bp,开放阅读框(ORF)长为300 bp,共编码99个氨基酸,包含一段由27个氨基酸组成的信号肽和72个氨基酸的成熟肽,分子量为10 924.7 u。氨基酸序列分析表明,该序列存在明显的跨膜结构和疏水区。同源性分析表明,该基因编码的蛋白与海兔(Aplysia californica)theromacin氨基酸序列的相似度最高为56%,而与...
关键词：
三角帆蚌 AMP基因 RACE 分子特征
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