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[期刊] 渔业科学进展
[作者]
于金红 潘鲁青
通过RT-PCR扩增三疣梭子蟹C-型凝集素(C-type lectin like-domain protein,CTLD)基因序列,将目的基因克隆入质粒pET32a,构建原核表达重组质粒pET32a-CTLD。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,通过IPTG诱导CTLD的表达,对其表达产物进行SDS-PAGE和Western blot检测。用His GraviTrap Ni亲和层析柱及超滤离心管纯化目的蛋白,并对其进行活性检验。结果表明,构建得到CTLD基因的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段相符的外源基因插入片段,经测序与目的序列完全一致;诱导表达出相对分子质量(M)39 600的目的蛋...
[期刊] 水产学报
[作者]
于金红 潘鲁青 张辉
为研究凡纳滨对虾C-型凝集素的免疫功能,实验利用原核表达系统对凡纳滨对虾C-型凝集素基因的开放阅读框进行了重组表达,并通过纯化分离获得重组目的蛋白,采用血细胞悬浮培养的方法,研究了重组C-型凝集素对凡纳滨对虾血细胞免疫作用的影响。实验梯度设置为对照组和重组C-型凝集素蛋白(1.0 mg/mL),分别在0、3、6、9、12、24 h取培养的血细胞和培养液进行免疫相关指标的测定。结果表明,重组C-型凝集素经SDS-PAGE分析显示在39 ku处有显著诱导条带,与预测的分子量大小基本一致,Western-blotting分析可以与anti-His抗体特异性结合,从而证明C-型凝集素重组蛋白在大肠杆菌...
[期刊] 水产学报
[作者]
杨宁 周素明 王国良 刘顺 李猛
B型清道夫受体是清道夫受体超家族成员,可识别多种配体,在机体脂类转运及免疫防御过程中发挥重要作用。为深入研究三疣梭子蟹B型清道夫受体(Pt-SRB)的功能,本实验在前期工作基础上构建了Pt-SRB胞外结构域原核表达载体,并成功获得了重组蛋白rPt-SRB。利用亲和层析方法获得纯化的rPt-SRB,并将纯化rPt-SRB蛋白免疫大鼠获得抗rPt-SRB重组蛋白免疫抗血清以用于后续研究。SDS-PAGE检测发现,体外诱导表达重组rPt-SRB以包涵体的形式出现在大肠杆菌BL21裂解液的沉淀中,分子量大小约为4
[期刊] 中国水产科学
[作者]
黄少君 许强华
为验证Ferritin基因是否对三疣梭子蟹的盐度胁迫具有适应性,利用PCR扩增获得了三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)第六对鳃的Ferritin基因,将该目的基因克隆到表达载体pET28a(+)中,转化大肠杆菌DE3(BL21),并进行IPTG诱导表达。结果表明:经诱导的转pET28-Ferritin重组质粒菌株有特异的表达蛋白条带出现,与预期的理论值(19.448 kD)相符合;高盐胁迫下,转重组质粒的大肠杆菌比转pET28空载质粒存活率显著提高(P<0.001),并且随盐度升高,两者差异越显著。这表明Ferritin基因能够提高大肠杆菌的盐度耐受力,由此推测Fer...
关键词：
三疣梭子蟹 铁蛋白 原核表达 盐度适应
[期刊] 水产学报
[作者]
刘逸尘 刘丽静 张亦陈 耿绪云 孙妍 孙金生
研究拟通过分析对虾C型凝集素的活性特点,探讨其在对虾先天免疫应答过程中的潜在功能以及在养殖生产实践中的应用。实验利用原核表达系统对中国明对虾C-型凝集素基因的两个串联的糖识别结构域(carbohydrate recognition domain,CRD)进行了重组表达,并通过纯化复性获得了重组目的蛋白(rFclectin-CRD1和rFclectin-CRD2)。活性分析结果显示,重组目的蛋白对多种病原菌有凝集和抑制生长的作用,并且具有Ca2+依赖活性;其凝集活性可被半乳糖、肽聚糖、脂多糖等多种病原相关分子模式所抑制,研究结果证实,Fclectin是一种典型的C-型凝集素,它可能作为中国明对虾...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张龙涛 吕建建 高保全 刘萍 付萍
采用ＲＡＣＥ技术，克隆出三疣梭子蟹（ＰｏＲｔｕｎｕｓ ｔＲｉｔｕｂＥＲＣｕｌＡｔｕｓ）核受体基因ＨＲ３８的Ｃ ＤｎＡ全长，命名为ＰｔＨＲ３８。该基因Ｃ ＤｎＡ序列全长为２９５０ ｂＰ，５′和３′非编码区（ｕｔＲ）长分别为１０１ ｂＰ和５５１ ｂＰ，开放阅读框（ｏＲＦ）长２２９８ ｂＰ。推测编码７６５个氨基酸，预测分子量为８４．２ ｋ Ｄ，理论等电点为６．３。生物学分析预测，ＰｔＨＲ３８基因编码的蛋白属于不稳定蛋白，不具有跨膜结构域。同源性分析表明，ＰｔＨＲ３８基因编码的氨基酸序列与大型溞（ＤＡＰＨｎｉＡ ｍＡｇｎＡ）的同源性最高。实时荧光定量分析表明，ＰｔＨＲ３８基因在蜕皮周期的各个组织中均有．．．
[期刊] 水产学报
[作者]
覃烨 许强华
为证明三疣梭子蟹HSP90a蛋白与盐度胁迫的相关性,实验根据GenBank上提供的三疣梭子蟹HSP90a基因蛋白编码区序列,构建pET28-HSP90a原核表达重组质粒在大肠杆菌DE3(BL21)中进行的盐度胁迫表达。结果显示,转重组质粒的大肠杆菌生存率明显高于转空载体的大肠杆菌,越接近大肠杆菌盐度耐受极限值,两者差异越显著,在盐度胁迫最高值(1 050 mmol/L)下,两者差异达到10.7倍,说明在盐度胁迫下三疣梭子蟹HSP90a对大肠杆菌有保护作用,能显著提高大肠杆菌对盐度胁迫的耐受力。由此推测,HSP90a蛋白可能参与了三疣梭子蟹盐度适应的生理过程。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
冯艳艳 李健 张德宁 刘萍 吕建建 高保全
取健康三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)‘黄选1号’80日龄幼蟹,体重(32.66±6.27)g。通过RT-PCR及Smart-TM Race技术,克隆了三疣梭子蟹谷胱甘肽S-转移酶(glutathiones-transferase,简称GST)基因c DNA全长序列(Gen Bank登录号:KF781517)。GST基因全长1 010 bp,编码一个由216个氨基酸组成的多肽,预测理论等电点PI为5.294,分子量为24.59 k D。氨基酸序列中含有GST基因家族特有GST-N结构域和GST-C结构域。同源性及系统进化分析表明,三疣梭子蟹GST基因与中华绒螯蟹(...
[期刊] 水产学报
[作者]
崔晓雨 朱冬发 汤洁 谢熙 邱锡尔
为研究蜕皮激素受体(EcR)在甲壳动物生长和生殖过程中的作用,采用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆了三疣梭子蟹蜕皮激素受体(PtEcR)基因全长cDNA序列(GenBank登录号:KC354381),运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,分析该基因在不同组织、蜕皮时期和二次卵巢发育阶段的表达特征。结果表明,PtEcR cDNA全长2 231 bp,包含1 269 bp ORF,编码422个氨基酸;推导的PtEcR氨基酸序列与已公布的其他甲壳动物EcR进行比对,发现一致性达67%~97%;系统进化树分析PtEcR与其它甲壳动物EcR聚为一支,而昆虫...
[期刊] 水产学报
[作者]
陈寅儿 金珊 张樱 赵青松 王国良 王春琳
将扩增得到的三疣梭子蟹LGBP基因开放阅读框与表达载体pET-22b(+)连接,转化E.coil BL21(DE3)plysE后IPTG诱导表达。经SDS-PAGE检测,发现诱导组比空载体和未诱导组多出一条分子量约为41 ku的表达产物,与预测的重组蛋白分子量大小基本一致。重组质粒在不同IPTG浓度和不同温度条件下诱导表达产物的SDS-PAGE分析结果显示,低浓度0.4 mmol/L IPTG和30℃诱导能有效减少菌体蛋白的本底表达。用纯化的重组蛋白连续免疫小鼠,4周后得到抗血清,经Western-blotting检测,其具有很好的特异性。微生物结合实验表明,重组表达的pET-LGBP具有较强...
[期刊] 水产学报
[作者]
孙盛明 傅洪拓 宣富君 戈贤平 朱健 吴旭干
C型凝集素(C-type lectin)是一类能与糖类结合的非抗体的蛋白质或糖蛋白家族,为了研究C型凝集素基因在日本沼虾组织分布、细胞定位和细菌感染过程中的表达情况,本研究应用cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了日本沼虾C型凝集素结构域家族3基因(MnLec3)的全长序列,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MnLec3基因在不同组织、细菌感染后不同时间的表达水平,Western blot和免疫荧光分别分析蛋白的表达水平和细胞定位。结果显示,MnLec3基因cDNA全长1 357 bp,包括125 bp的5′末端非翻译区(UTR)、1 026 bp的开放阅读框(ORF)和206 bp的3′UTR,其中开放阅读框编码341个氨基酸。氨基酸序列比对显示,日本沼虾MnLec3基因含有保守钙结合点(Met 1-Glu17)和糖识别结构域(CRD)。同源性分析结果显示,MnLec3与罗氏沼虾C型凝集素3相似度较高;邻接法(Neighbor-Joining,NJ)进化树分析结果显示,MnLec3与其他甲壳动物C型凝集素聚为一支。通过构建原核表达载体获得体外重组蛋白rMnLec3,并将纯化重组蛋白免疫大鼠获得抗血清,免疫荧光结果显示,绿色荧光信号主要在肝胰腺细胞核中表达。qRT-PCR结果显示,MnLec3在日本沼虾所检测组织中均表达,其中肝胰腺中表达量最高,血细胞次之;与对照组相比,在嗜水气单胞菌刺激12～48 h时MnLec3表达量显著升高,48 h表达量最高,Western blot分析结果显示,MnLec3蛋白表达丰度与基因表达模式基本相似,提示克隆得到的MnLec3参与日本沼虾抵御细菌入侵的免疫过程。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
陆洋 吴旭干 潘桂平 王伟 候文杰 成永旭
雌激素相关受体（ＥＲＲ）在甲壳动物蜕皮过程中可能起着重要的调节作用，但是尚不清楚该基因在三疣梭子蟹不同组织和不同蜕皮阶段的表达模式。本文采用荧光定量ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）技术研究了三疣梭子蟹雌激素相关受体（ＰＴ ＥＲＲ）基因在不同组织和不同蜕皮阶段的表达情况。结果表明，ＰＴ ＥＲＲ－ｍＲＮＡ在Ｃ期三疣梭子蟹的Ｙ器官和鳃中表达水平最高，其次眼柄和胃中表达水平也相对较高，在３种肌肉组织和三角膜中表达水平较低。在不同蜕皮阶段，１３种组织中的ＰＴ ＥＲＲ－ｍＲＮＡ表达水平均差异显著。Ｙ器官中ＰＴ ＥＲＲ－ｍＲＮＡ从ＡＢ期到Ｅ期呈显著上升趋势；胸神经节和眼柄中的ＰＴ ＥＲＲ－ｍＲＮＡ变化模式均为先上升．．．
[期刊] 水产学报
[作者]
陆洋 吴旭干 柳梅梅 巩杰 成永旭
实验通过活体注射、养殖实验和荧光定量PCR等方法,研究了不同浓度TAM对三疣梭子蟹雌体成活率、卵巢指数、肝胰腺指数及卵巢发育相关基因表达的影响,旨在探讨雌激素对甲壳动物卵巢发育的作用机制。结果显示,不同浓度TAM对雌体存活率和肝胰腺指数均无显著影响,但在一定程度上抑制了卵巢指数。不同组织中的卵黄蛋白原(Vg)、雌激素相关受体(ERR)、维甲酸受体(RXR)和蜕皮激素受体(EcR)基因表达均受到了TAM的影响:Vg基因在卵巢和肝胰腺中的表达水平明显受到TAM的抑制;低浓度TAM组(6.7和13.4μg/g)
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
张晓燕 李健 刘萍 陈萍 孙铭 葛红星
通过简并引物扩增及Smart TM Race技术,首次克隆了三疣梭子蟹Portunus trituberculatus蜕皮激素受体EcR基因cDNA全长序列。该基因全长2 996bp,编码一个由503个氨基酸组成的多肽,预测理论等电点pI为7.33,分子量大小为55.69kDa。同源性及系统进化分析表明,三疣梭子蟹EcR基因与青蟹、拟穴青蟹、大西洋招潮蟹、陆地蟹、美洲螯虾、褐虾、日本对虾的同源性分别为94%、90%、88%、84%、82%、73%、66%。荧光定量RT-PCR结果表明,EcR在肝胰腺、卵巢、肌肉、眼柄、鳃和心脏中均有分布,在肝胰腺中表达量最高,在心脏中最低。高盐(45)胁迫下,...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
王磊 任宪云 宋柳 吕建建 高保全 刘萍 孙东方
本研究利用RACE方法克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)凋亡蛋白酶激活因子-1(Apoptoticproteaseactivatingfactor-1,Apaf-1)基因,该基因c DNA全长为2032bp,其中,ORF为1050 bp,编码349个氨基酸,预测分子量为39.13 kDa,理论等电点为7.67。同源性和系统发育分析显示,Apaf-1与凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)Apaf-1的同源性最高,为51.27%,并与凡纳滨对虾聚为一支。组织表达分析显示,Apaf-1基因的相对表达水平在肝胰脏最高,其次是肌肉、心脏、鳃和眼柄,血细胞和表皮最低。不同盐度胁迫后,Apaf-1在Ⅱ期幼蟹体内表达水平在3 h达到最大值,此后,呈先下降再上升趋势;Apaf-1在80日龄盐度20胁迫后三疣梭子蟹的鳃中呈上升趋势,在肝胰腺中为先上升后下降趋势,表明盐度改变能影响该基因在鳃和肝胰腺组织中的表达。不同病原感染实验结果显示,在血细胞中,注射副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)后Apaf-1的表达于48 h到达峰值,为对照组的2.76倍(P<0.05),注射WSSV后在12h到达峰值,为对照组的5.89倍(P<0.05),整体呈上调表达趋势。本研究为进一步理解三疣梭子蟹Apaf-1基因的生理功能提供了参考。
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