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[期刊] 华北农学报
[作者]
李欣 崔秀明 刘迪秋 孙恬 郭爱玲 陈军
为了建立一种准确、快速检测三七根腐病病原真菌尖孢镰刀菌的实时荧光定量PCR方法,基于尖孢镰刀菌脂肪酸ω-羟化酶基因设计了实时荧光定量PCR的特异性引物对Fo-QF和Fo-QR,制备了该基因的重组质粒标准品,建立了尖孢镰刀菌的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。从三七种植区采集到14个具有根腐病、黑斑病典型症状的三七病株及三七种植土壤样品,并提取了这些样品的总DNA,运用本研究建立的荧光定量PCR方法进行了检测。结果显示,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法特异性强,脂肪酸ω-羟化酶基因只以尖孢镰刀菌DNA为模板扩增出特异的PCR产物。此外,该方法灵敏度高,检测模板浓度可低至0. 35 pg/μL。构建的荧光定量PCR标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线的吸收峰单一,扩增效率好。利用该定量检测体系,能从几种不同的三七病株中快速检测出携带尖孢镰刀菌的根腐病病株,从而达到准确诊断的目的。本方法不仅能明确三七种植土壤以及三七病株中尖孢镰刀菌数量的动态变化,并且可以为三七土壤处理、根腐病的早期诊断和动态监测以及带病三七种子、种苗的快速分子检测提供技术支持。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郑新添 黄翠琴 黄其春 戴爱玲 谭晓珺
【目的】建立检测胞内劳森菌的ＳＹＢＲ ＧＲｅｅｎⅠＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ方法，为猪增生性肠炎的准确诊断奠定基础。【方法】针对胞内劳森菌１６ＳＲＤｎａ序列设计引物，扩增１６ＳＲＤｎａ，构建Ｐｔ－ｌｉ－１６Ｓ重组质粒。以Ｐｔ－ｌｉ－１６Ｓ为模板建立检测胞内劳森菌的ＳＹＢＲ ＧＲｅｅｎⅠＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ方法，检测其特异性、敏感性和重复性，并用该方法对５１份疑似增生性肠炎病例进行检测。【结果】建立的ＳＹＢＲ ＧＲｅｅｎⅠＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ方法特异性强，与大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和副猪嗜血杆菌等无交叉反应；在标准质粒含量为１．０×１０２～１．０×１０８拷贝／μｌ时，质粒含．．．
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
赵文军 朱水芳 夏明星 陈红运
[期刊] 淡水渔业
[作者]
刘衍鹏 黄冠军 刘天强 李爱华 肖丹
根据弧菌属细菌(Vibrio spp.)共有的rpo A基因序列,比对和设计了一对PCR引物,建立了能够快速而准确地检测弧菌属细菌的通用PCR检测方法,该方法对靶标DNA的检测灵敏度为58 fg/μL,对菌液的检测灵敏度为2.7×102cfu/m L,能够区分该属细菌与其它属的细菌,具有极高的特异性。使用建立的方法对分离自南美白对虾的病原菌进行了检验,并结合16S r DNA序列分析,结果显示待检测病原均为弧菌属的细菌,与测序结果一致,说明该检测方法可用于弧菌属细菌的检测和诊断。
关键词：
弧菌属细菌 rpo A基因 特异性 检验
[期刊] 水产学报
[作者]
周勇 曾令兵 张辉 范玉顶 徐进
针对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)DNA解旋酶基因编码区序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增出长度为1 446 bp的基因编码区片段,克隆到pMD19T载体上,构建重组质粒。经PCR鉴定与测序分析确认正确后,以10倍梯度稀释重组质粒,作为标准模板进行TaqMan real-time PCR扩增,制作标准曲线,建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型的荧光定量PCR检测方法。检测结果显示,标准曲线的相关系数(R2)达到0.999 1,斜率为-3.412;对初始模板定量检测的范围为1×101～1×107copies/μL;特异性试验结果表明,该方法可特异性地检测出鲤疱疹...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
陈千林 刘梦丽 许正茂 王振宝 吉尔格力 史亚明 巴音查汗
为建立牛感染犬新孢子虫的Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测方法，根据犬新孢子虫ＮＣ２基因保守序列设计特异性检测引物和ｔａｑｍａＮ－ｍＧＢ探针，建立新孢子虫病ｔａｑｍａＮ－ｍＧＢ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测方法。ＰＣＲ扩增产物约为１５０ＢＰ，与预期片段大小相符；Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ扩增表明，Ｃｔ值与梯度稀释的阳性质粒模板呈良好的线性关系；当检测牛源性弓形虫、牛环形泰勒和牛巴贝斯等虫种阳性ＤＮａ时均为阴性；经３Ｄ数字ＰＣＲ判定，Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ方法的最低有效检测量为６．４１拷贝／μｌ，灵敏性是常规ＰＣＲ的１ ０００倍；重复性试验的组内平均变异系数为１．１０８％，组间为２．７３２％；．．．
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
董文盼 杨纪潇 杨项明 吕明慧 朱彦泽 蒋春号
[目的]本文构建了西瓜枯萎病菌—尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveum，FON）的重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification， RPA）的快速检测体系，以期为田间西瓜枯萎病的快速检测提供技术支持。[方法]从NCBI网站下载包括西瓜枯萎病菌在内的11种病原真菌的基因组序列，利用SeqHunter2软件进行生物信息学分析，经比对得到4个FON的特异性基因片段，并对其进行引物设计和筛选。利用聚合酶链式反应（PCR）验证引物的特异性和灵敏度，而后利用建立的RPA检测体系对引物的特异性和灵敏度进行验证，最后进行人工接种FON的西瓜植株的RPA检测与评价。[结果]本文首次报道了FON的RPA检测体系，并对DNA恒温快速扩增试剂盒的扩增体系进行最佳反应时间（40 min）和最适反应温度（30℃）的摸索，得到其最佳反应体系的检测下限为100 pg/μL。利用DNA恒温快速扩增试剂盒（胶体金试纸条型）进行扩增时，只需在38℃反应12 min，取50 μL稀释20倍的扩增产物用胶体金试纸条进行检测，5 min后即可进行结果的判断，检测下限为100 pg/μL。[结论]本文通过多种检测方法对RPA扩增结果进行检测，均得到一致的结果，且建立的RPA检测体系能够从温室接种FON之后未显症的西瓜植物组织基因组DNA中检测到FON，可为田间西瓜枯萎病早期的快速检测提供技术支持。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
韩广涛 杨志辉 朱杰华 赵冬梅 韩彦卿
【目的】利用双重PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌(Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus)和黑胫病菌(Pectobacterium atroseptica)。【方法】根据GenBank上发表的马铃薯环腐病菌pCS1质粒上纤维素酶A基因序列,对比近缘种及马铃薯上几种重要病原菌的核苷酸序列,设计并合成了1对特异性引物CMS1/CMS2,将设计的引物与已发表的PCR检测马铃薯黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r结合,经过条件优化后,建立了双重PCR体系。【结果】利用引物CMS1/CMS2扩增出了1条913 bp的马铃薯环腐病菌特异性条带。检测灵敏度...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
翟晓虎 李翎旭 陈小竹 蒋怀德 贺卫华 姚大伟
【目的】建立一种快速、准确的肉中猪源性成分定量检测方法。【方法】首先从GenBank数据库中筛选猪特异性的微卫星DNA，根据微卫星DNA核酸序列设计引物，对常见10种动物基因组DNA进行PCR扩增，通过有无扩增产物判断筛选的微卫星DNA对猪源性成分的特异性。然后根据微卫星DNA核酸序列，设计特异性引物和探针，建立猪源性成分Real-time PCR检测方法，采用双标准曲线分别对猪源性成分和总动物源性成分进行定量，计算猪源性成分的百分含量。【结果】筛选到猪特异性微卫星DNA(Accession EF172428)，根据其序列设计的引物SEQ-sus2-F/R只能从猪基因组DNA中扩增出目的条带，其他动物的基因组均无目的条带扩增。建立的Real-time PCR检测方法灵敏度为0.02 ng/25μL反应体系。该方法能够准确检测出混合DNA样品中猪源性成分和混合肉样品中猪源性成分，百分误差分别约为1.32%和1.06%—7.12%。【结论】本研究利用Real-time PCR技术建立的定量猪源性成分的检测方法可以用来检测猪源性成分在混合样品中的百分含量。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
尹全 宋君 刘勇 刘红雨 黄小琴
根据GenBank中根肿病菌的保守序列,设计了一对引物,该引物能从供试的根肿病菌根组织中特异性扩增出一条498bp的预期条带。采用改良土壤DNA提取方法对人工配制病土中根肿病菌休眠孢子DNA提取,通过检测不同稀释度和不同孢子量的DNA检测结果证明,该检测方法能检测出土壤根肿病菌含量大于104个孢子/g孢子浓度的带菌土壤,且该方法具有快速、准确、简便、有效的特点。
关键词：
根肿病菌 休眠孢子 PCR 土壤检测
[期刊] 浙江林学院学报
[作者]
李河 宋光桃 何末军 郝艳 周国英
为建立油茶Camellia oleifera根腐病菌层生镰刀菌Fusarium proliferatum的巢式聚合酶链式反应(PCR)快速检测体系,扩增层生镰刀菌核糖体DNA基因间隔序列(ITS)区并测定其序列,比较该序列与GenBank中近似种的ITS序列差异,设计了特异性引物GF1和GR2,利用该对引物与ITS1和ITS4进行巢式PCR扩增检测层生镰刀菌。结果显示,巢式PCR对层生镰刀菌的检测灵敏度可达100ag基因组DNA,比常规扩增方法提高了1万倍。利用设计的GF1/GR2特异性引物与ITS区通用引物进行巢式PCR扩增,可灵敏地扩增出油茶根腐病菌层生镰刀菌DNA。
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘树森 郭宁 孙华 马红霞 张海剑 石洁
麦根腐平脐蠕孢是玉米根腐病的重要病原菌之一，旨为建立一种基于环介导等温扩增技术(LAMP)的麦根腐平脐蠕孢快速检测方法。首先，根据麦根腐平脐蠕孢参与黑色素生物合成途径的Brn1基因部分序列设计了一套LAMP检测引物；然后，针对该引物组筛选了其最佳反应温度，检测了LAMP反应的特异性和灵敏度，并以人工接种麦根腐平脐蠕孢的玉米根腐病病株为样本评价了LAMP检测方法的效果。结果表明，本研究设计的引物组在61～68℃条件下均能实现对靶标基因的扩增，其中以66℃为最佳反应温度；在特异性检测中，引物组能从10种分离自玉米根腐病样本的主要病原真菌DNA中特异性地检测出麦根腐平脐蠕孢；在灵敏度检测中，对携带靶基因Brn1的质粒DNA最低检测限是10 copies/μL,在此检测限浓度下，25 min左右即可实现扩增；在对玉米根腐病样本检测中，在1 pg/μL的玉米根组织DNA中即可检测出麦根腐平脐蠕孢。建立的麦根腐平脐蠕孢LAMP检测方法具有较强的特异性和较高的灵敏度。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
赵绪永 马辉 宁豫昌 赵丽
【目的】建立可同时检测猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的多重实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank数据库中PRV、PPV和PCV2的核苷酸序列,设计3对特异性引物和探针,以10倍系列稀释的阳性质粒为模板,优化反应条件,建立检测PRV、PPV和PCV2的多重Real-time PCR方法,并对其敏感性、重复性和特异性进行检验;分别采用单项和多重Real-time PCR方法,对临床收集的42份疑似病料进行检测,比较2种方法的符合率。【结果】特异性和灵敏度试验表明,建立的多重Real-time PCR检测方法具有高度特异性,与其他病原无明显交叉反...
[期刊] 水产学报
[作者]
殷亮 王庆 曾伟伟 李永刚 王英英 刘春 梁红茹 石存斌 吴淑勤
为了建立和应用可检测基因Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的荧光定量检测方法,实验根据基因Ⅰ型GCRV的S6保守序列,分别设计扩增目的条带661 bp普通引物(P1、P2)、扩增目的条带159 bp荧光定量引物(F1、F2)和一条探针;同时构建含有目的片段的PVAX1-S6作为标准质粒,10倍梯度稀释构建质粒拷贝数与Ct值的标准曲线(Y=-3.389X+38.076)。结果表明,此方法在3.9×107~3.9×101拷贝/μL之间相关性较好,R2为0.992,最小检测量为4拷贝/μL;且与基因Ⅱ型、Ⅲ型GCRV以及其他病原核酸无交叉反应。运用该方法检测16份草鱼出血病疑似样品,阳性结果为4份;而普...
[期刊] 华北农学报
[作者]
严蕾艳 张宴瑜 马凯慧 宋慧 王毓洪
为了更快更准确地在病菌潜伏期或发病初期鉴定出尖孢镰刀菌引起的瓜类枯萎病和茄病镰刀菌引起的瓜类根腐病这2种病害,根据尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌的翻译延长因子TEF1-α序列设计了3条种特异性引物。引物对FO-F和Fu-R可以从尖孢镰刀菌中扩增到1条228 bp的片段,引物对FS-F和Fu-R可以从茄病镰刀菌中扩增到1条347 bp片段,并且3条引物FO-F、FS-F和Fu-R可以同时在1个PCR反应中扩增到2个片段,而这2对引物都不能从其他病原真菌中扩增到任何条带。结果表明,该多重PCR检测方法可以同时鉴定样品中的2种镰刀菌。
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