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[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
袁军 刘海荣 庄振宏 汪世华
将丁香假单胞菌番茄变种DC3000(P.syringae pv.tomato DC3000)极毛蛋白hrpA基因克隆到pET32a(+)载体上,获得重组表达载体pET32a(+)-hrpA.将重组质粒转入宿主E.coli BL21(DE3)溶源菌中,通过SDS-PAGE分析表明,在1.0mmol.L-1异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)的诱导下,重组子成功表达了分子质量约为28 ku的融合蛋白(目标蛋白基因与硫氧还蛋白基因的融合表达产物).并利用Ni2+-NTA柱亲和层析分离获得纯化的HrpA蛋白,质量浓度为91.8 g.L-1.
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张岩 伍辉军 周晓辉 高学文
采用PCR方法从丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)A1和S1菌株中分别克隆到大小为1 026和1 038 bp的hrpZ基因(hrpZPsgA1和hrpZPsgS1),对该基因进行了原核表达和功能研究。SDS-PAGE显示其表达产物为相对分子质量62×103的融合蛋白,harpinZPsgA1和harpinZPsgS1的相对分子质量约为35×103。harpinZPsgS1的粗提蛋白经GSTrap FF纯化后质量浓度可达1.1 mg.mL-1。生物活性检测表明,该蛋白对热稳定,对蛋白酶K敏感,可以在非寄主植物烟草上激发过敏反应,过敏反应可...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
罗维 余兴龙 白霞 李润成 侯强红 尹恒
根据Z26520中fedF序列设计1对引物,从发病仔猪的腹泻粪便分离获得的大肠杆菌中扩增得到fedF基因,经纯化、连接、转化,将其成功克隆到pMD18-T中,所克隆fedF基因序列与GenBank中收录的其他fedF基因序列的同源性达97.8%～99.2%.另设计1对引物,利用基因工程方法将所克隆的fedF的编码序列亚克隆到表达载体pBV220中,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得表达重组菌.测序结果表明,插入编码序列与预期序列一致.SDS-PAGE电泳及Western-blotting分析表明,重组菌在诱导后可以表达特异性的相对分子质量为30 100的FedF蛋白.
关键词：
大肠杆菌 fedF基因 克隆 表达
[期刊] 水产学报
[作者]
梁海鹰 夏立群 吴灶和 简纪常 鲁义善
参照GenBank上登录的弧菌鞭毛蛋白flaB基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的flaB全长基因,序列分析结果显示该基因为1134bp,编码377个氨基酸。与GenBank中其它弧菌的同源基因序列比对显示,溶藻弧菌flaB基因与副溶血弧菌flaB基因的同源性最高(92%)。将该基因定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出带His-tag的融合蛋白,分子量大小与预期一致。优化的表达条件为28℃,0.4mmol/LIPTG浓度诱导10h。用纯化后的融合蛋白免疫SPF级小鼠,制备了多克隆抗体。Western-blotting结果表明鼠抗...
[期刊] 华北农学报
[作者]
张梅娟 沙伟 刘博 安洪雪 宋璐
为研究类泛素蛋白基因在苔藓植物中的生物学功能,从毛尖紫萼藓干旱c DNA文库中获得了类泛素蛋白基因c DNA全长序列,命名为Gp-UBL5。该基因c DNA全长471 bp,包含1个222 bp的完整开放阅读框,编码73个氨基酸组成的蛋白。生物信息学分析表明,Gp-UBL5基因编码蛋白分子质量为8.525 k Da,等电点为7.84,为稳定型蛋白。进化分析显示,该编码蛋白与二穗短柄草、大麦等类泛素蛋白具有较高一致性,达96%~99%。实时荧光定量PCR结果表明,Gp-UBL5基因在复水和快速干旱的各个时期均有表达,推测该基因可能在毛尖紫萼藓的抗旱机制中发挥作用。
[期刊] 水产学报
[作者]
欧阳岁东 林天龙 陈孝煊 俞伏松 龚晖 陈红燕 方勤美
A pair of primers were designed according to the published nucleotide sequence of a putative outer membrane protein gene(omp) of Aeromonas hydrophila.With the specific primers,a target fragment about 1.1 kb was amplified from Aeromonas hydrophila ML316 via PCR.The target fragment was inserted into t...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张聪 徐建强 于俊杰 陈长军 王建新 周明国
分别扩增了禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵(MBC)敏感菌株(MBCS)的β1-微管蛋白基因(β1-S)和β2-微管蛋白基因(β2-S),及多菌灵中抗菌株(MBCMR)和高抗菌株(MBCHR)的β2-微管蛋白基因(β2-MR和β2-HR),测序正确后连接到pET32a(+)原核表达载体上,转化至大肠杆菌Rosepta感受态中,经IPTG(1 mmol.L-1)诱导,得到了N末端融合6×His纯化标签的表达产物。SDS-PAGE电泳分析表明:在大肠杆菌中表达了相对分子质量约68×103的蛋白,和预测蛋白大小一致,表达的产物主要以包涵体的形式存在。表达的蛋白经HisT...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
邓杰夫 李魏 雷玲 洪艳云 刘双清 戴良英 易图永
为进一步了解柑橘黄龙病菌亚洲种Clas的致病机理，从Prasad预测的166种分泌蛋白中选取1个在柑橘植株中表达量较高的CLIBASIA–04580基因进行研究。提取感染柑橘黄龙病的柑橘叶片总DNA，经 PCR扩增得到 CLIBASIA–04580基因，切胶回收PCR产物双酶切连接到pET–28a载体上，使用菌落PCR和限制性内切酶双酶切鉴定筛选阳性克隆；转化大肠杆菌 BL21(DE3)，使用0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG) 诱导重组蛋白表达融合组氨酸标签的CLIBASIA–04580重组蛋白，聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS–PAGE)检测重组蛋白的表达水平，然后使用蛋白纯化镍柱进行纯化。结果表明，携带组氨酸标签的CLIBASIA–04580重组蛋白得到表达，且异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度为1.5 mmol/L时相对表达量达到峰值，通过SDS–PAGE凝胶分析，与未经过镍柱纯化的蛋白原液比较可知成功纯化了CLIBASIA–04580重组蛋白。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
邓杰夫 李魏 雷玲 洪艳云 刘双清 戴良英 易图永
为进一步了解柑橘黄龙病菌亚洲种Clas的致病机理，从Prasad预测的166种分泌蛋白中选取1个在柑橘植株中表达量较高的CLIBASIA–04580基因进行研究。提取感染柑橘黄龙病的柑橘叶片总DNA，经 PCR扩增得到 CLIBASIA–04580基因，切胶回收PCR产物双酶切连接到pET–28a载体上，使用菌落PCR和限制性内切酶双酶切鉴定筛选阳性克隆；转化大肠杆菌 BL21(DE3)，使用0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG) 诱导重组蛋白表达融合组氨酸标签的CLIBASIA–04580重组蛋白，聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS–PAGE)检测重组蛋白的表达水平，然后使用蛋白纯化镍柱进行纯化。结果表明，携带组氨酸标签的CLIBASIA–04580重组蛋白得到表达，且异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度为1.5 mmol/L时相对表达量达到峰值，通过SDS–PAGE凝胶分析，与未经过镍柱纯化的蛋白原液比较可知成功纯化了CLIBASIA–04580重组蛋白。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
王伟 白俊杰 劳海华 叶星 罗建仁
根据已报道的Mx蛋白cDNA序列设计合成特异引物,应用逆转录 聚合酶链式反应(RT PCR)方法,从草鱼呼肠孤病毒(GCRV)诱导的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)肝脏总RNA中扩增获得Mx蛋白cDNA,回收纯化后克隆到pGEM TEasyVector系统的T载体上。重组子的序列分析表明:所克隆的Mx蛋白cDNA长722bp,编码240个氨基酸,包括1个三联GTP结合区域和1个发动蛋白(dynamin)族特征的序列。与已知鱼类Mx蛋白基因序列比较表明,草鱼Mx蛋白基因序列与其它鱼类Mx基因相应序列具有较高的同源性,其中与斑马鱼Mx蛋白E型基因碱基序列比较同源性最高,为87...
关键词：
草鱼 Mx蛋白基因 基因克隆 原核表达
[期刊] 林业科学
[作者]
唐征 杨凯 冯永庆 曹庆芹 沈元月 秦岭
利用RACE技术从板栗短雄花序突变体中扩增得到660bp的板栗脂质转运蛋白(lipid transfer protein,LTP)cDNA片段。该cDNA编码118个氨基酸,具有8个位置保守的半胱氨酸(C)残基及26个氨基酸的信号肽,它与棉花、草莓脂质转运蛋白氨基酸序列相似性为63%,基因序列已提交数据库(GenBank),其登录号分别为FJ490676(基因)和ACL01093(蛋白)。荧光定量分析表明板栗短雄花序突变体较正常雄花序的脂质转运蛋白表达量更高。将板栗脂质转运蛋白基因插入到硫氧还蛋白融合表达载体pET32a(+)中,构建了板栗的原核表达载体pET-LTP,在大肠杆菌菌株Roset...
[期刊] 水产学报
[作者]
梁银龙 曹敏杰 郭川 苏文金 张凌晶 刘光明
通过分子生物学技术方法,分别克隆得到锯缘青蟹(Scylla serrata)、中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)和三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的原肌球蛋白基因序列。测序结果表明,三个基因的序列长度均为855 bp,编码284个氨基酸残基,三者氨基酸序列同源性为99.3%。三种蟹的原肌球蛋白基因序列与GenBank中其他甲壳类动物的原肌球蛋白具有很高的同源性。将锯缘青蟹的原肌球蛋白基因与pGEX-4T-3载体连接后,经IPTG诱导得到分子量约为61 ku的融合表达蛋白。通过与甲壳类过敏患者血清的免疫印迹反应,证实融合表达的原肌球蛋白具有过敏原性,...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
晏慧君 张颢 蹇洪英 王其刚 邱显钦 张婷 唐开学
【目的】克隆月季丁香酚合成酶基因RhEGS1的全长cDNA序列,分析其序列及表达特征,并对该基因编码的蛋白进行原核表达分析,为深入探讨丁香酚合成酶的生化特性奠定基础。【方法】根据已发表的其它植物EGS基因序列的保守结构域设计简并引物,结合RACE技术,获得RhEGS1的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用半定量RT-PCR对不同组织及不同花发育时期RhEGS1进行表达分析。采用Gateway克隆技术,构建原核表达载体,并进行原核蛋白表达。【结果】月季RhEGS1的cDNA全长为1 207 bp,包含一个927 bp的ORF,编码309个氨基酸。同源序列比对发现RhEGS1与仙女扇的Cb...
[期刊] 林业科学研究
[作者]
万友名 马宏 刘雄芳 张序 安静 刘秀贤 李正红
[目的]研究馥郁滇丁香LgFKF1基因的结构特点及其在特异组织中的节律表达特征,探索其在成花调控过程中的作用。[方法]采用RACE技术克隆获得馥郁滇丁香LgFKF1基因的cDNA全长序列,利用生物信息学方法对获得的基因核苷酸序列及编码蛋白质序列进行分析,利用qRT-PCR技术对特异组织的节律表达模式进行分析。[结果]序列分析表明:LgFKF1基因cDNA全长为2 271 bp,开放阅读框为1 917 bp,编码一个638个氨基酸的蛋白质;推导的氨基酸序列与扁果树、软枝黄蝉、纳塔尔倒吊笔、马利筋的FKF1蛋白具有较高同源性,达92.59%;预测LgFKF1蛋白属于不稳定的亲水性蛋白,定位在细胞核,无信号肽和跨膜区;结构主要由无规则卷曲结构、α螺旋结构、扩展长链和β-转角构成;遗传进化关系与扁果树最亲近。qRT-PCR分析表明:LgFKF1在诱导光周期下处理7 d时较非诱导光周期下的表达量高,而诱导光周期下处理10 d后其表达量则低于非诱导光周期的表达。一天中,LgFKF1在各组织中均有表达,且以叶片中的相对表达量较高。LgFKF1因组织不同在不同的时间呈现出单峰和双峰表达,其中,根、芽及花蕾中均在夜间23:00出现单峰表达;茎、叶及开放的花朵中在不同时间出现双峰表达,茎在晚上20:00和凌晨5:00,叶在凌晨2:00和早上8:00,开放花朵在夜间23:00和凌晨5:00。[结论]从馥郁滇丁香中克隆获得了LgFKF1基因,其编码的蛋白序列与其它植物的FKF1具有较高的同源性。LgFKF1基因的表达受光周期影响,在诱导光周期下,不同的组织呈现出不同的表达模式,其中,仅叶片中的1个表达峰值出现在白昼,其余组织中的表达峰值均出现在夜间。在各组织中,叶片中的表达量较高。LgFKF1基因的特异组织节律表达有助于为其生物学功能的进一步研究提供参考依据。
[期刊] 林业科学研究
[作者]
姜波 高彩球 王玉成 于丽丽 杨传平
在有机体的生长和发育过程中,基因表达在转录、转录后和翻译水平都受到严格地调控。转录调控是基因表达调控的第一步,曾被认为是基因表达的主要调控机制,但是随着对转录后调控机制越来
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