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[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
宋梦如 陈可钦 郭运娜 雷莹莹 代红艳
RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是研究基因功能的一种常用方法。为解决目前植物RNAi载体构建繁琐复杂的问题,本研究以常用的植物过量表达载体pRI 101-AN为基础,在其多克隆位点处插入源自pKANNIBAL载体的内含子序列,获得pRNAi-E载体。在此基础上,只要将目的基因特异序列的正反向片段分别连接到内含子两侧,即可构建目的基因的RNAi载体。为了验证pRNAi-E载体的效果,苹果IAA29(Md IAA29)基因的正向和反向片段被插入到pRNAi-E载体上,获得了Md I
关键词：
基因沉默 遗传转化 载体 RNAi
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
屈淑平 徐文龙 崔崇士
参照拟南芥WRKY33转录因子基因序列设计引物,利用RT-PCR技术从大白菜中克隆了WRKY33基因编码区460bp的序列,利用双链RNA介导的基因沉默技术,构建WRKY33基因沉默植物表达载体,为进一步研究该基因在植物与软腐病菌互作中的功能及其作用机制奠定基础。首先将WRKY基因片段连接至pUCm-T载体上,用PstⅠ/BamHⅠ和PstⅠ/XhoⅠ分别对pUCm-WRKY载体进行酶切,得到2个WRKY基因片段;先后将其连接到pBSSK-in载体上,构建成pBSSK-WRKY-in-WRKY载体,该载体中的2个WRKY片段大小一致,反向重复;并用SacⅠ/KpnⅠ酶切pBSSK-WRKY-i...
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
崔震海 蔡莹 张立军
玉米C4光合关键酶PEPC基因在玉米C4光合作用中起到重要作用,根据已测序的玉米C4-PEPC基因序列,设计2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以pBI121 C4-PEPC质粒DNA为模板,PCR扩增得到2个C4-PEPC基因片段。再将正向和反向两个片段分别经双酶切后插入植物表达载体pTA7002的XhoI和SpeI酶切位点之间,从而构建了以玉米C4-PEPC基因为靶标的RNAi植物表达载体p7002-Z-F。载体质粒经酶切鉴定正确后通过冻融法转入根癌农杆菌EHA105中,为后续探讨干扰载体的干涉PEPC基因表达效果奠定了基础。
关键词：
玉米 PEPC RNAi 植物表达载体
[期刊] 华北农学报
[作者]
于丛丛 马俊莲 宋春丽 陈佳
据已测序的上西早生柿ETR5基因序列,设计了2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个ETR5-Uenishiwase基因片段。2个片段经单酶切消化后连接成反向互补的大片断。连接片断经双酶切消化后,定向连接到植物表达载体pSMAK321的35S启动子和NOS终止子之间,构建成Uenishiwase-ETR5基因的RNA干扰植物表达载体。载体质粒经酶切鉴定正确后通过冻融法转入根癌农杆菌EHA101中。以上西柿组培苗叶片为外植体,优化遗传转化体系,结果表明:农杆菌重悬液和共培养基中均添加200μmol/L的AS及Spc梯度筛选能有效提高转化率。转化植株经PCR检测得到7...
[期刊] 浙江林学院学报
[作者]
哀建国 杨勇
基因沉默是生物体基因表达调控的一种重要机制,在各种生物体中普遍存在。基因沉默可以分为转录后基因沉默(post transcriptionalgenesilencing,PTGS)和转录基因沉默(transcriptionalgenesilencing,TGS)。最近的研究发现,在植物中,TGS和PTGS都和RNAi有关。RNA介导的基因沉默为大规模植物生化代谢途径和基因功能的研究提供了一种高通量的反向遗传学手段。简要地介绍了RNAi和RNA介导的DNA甲基化的分子机制,并介绍了RNA介导的基因沉默在植物体中的作用及其在植物基因工程方面的应用。图1参31
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘宽亮 赵志常 罗睿雄 陈业渊
为了探究杧果PAO基因在杧果果皮叶绿素降解中的作用,利用转录组测序得到PAO部分片段信息设计兼并引物,采取3’和5’cDNA末端快速克隆(RACE)的技术方法,选取了红色贵妃、黄色金煌、绿色桂七等3个不同着色杧果品种为试验材料,分别克隆得到了杧果果皮PAO基因的全长c DNA序列,生物信息学分析后将其命名为MiPAO。结果表明,3个着色品种c DNA序列只有几个碱基的差异,以红色贵妃品种为例,经过分析可得全长c DNA序列的大小为1 979 bp,开放阅读框大小为1 641 bp,总共编码546个氨基酸,其分子质量为61. 82 ku,等电点为6. 54。通过生物软件预测得到了MiPAO蛋白的二级结构和3种三级结构图,同时发现MiPAO蛋白为亲水性蛋白。对NCBI上登录的部分植物的PAO蛋白构建系统发育树发现MiPAO蛋白与橙子的亲缘关系近。成功构建出p TRV2-MiPAO基因沉默载体,希望能为后续研究杧果果皮着色的分子机理和桂七杧果的滞绿原因提供一定的试验支持。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
魏晓骁 王士亚 陈潇潇 汪凤林 曹光球 曹世江
为探索杉木木材形成的分子机制,以杉木嫩叶总RNA反转录的c DNA为模板,运用RT-PCR技术克隆出一个新杉木纤维素合酶基因ClCesA.该基因的开放阅读框(ORF)为2 955 bp,共编码984个氨基酸.通过TMHMM Server v.2.0和MEGA5.1软件预测ClCesA蛋白的跨膜结构和功能,发现该蛋白N端含有锌指结构,共有8个跨膜结构,平均跨膜区域18个氨基酸残基,并具有保守的DDDQXXLRW结构域.系统进化树分析结果表明,ClCesA可能与细胞次生壁形成有关.荧光定量PCR分析表明,Cl
[期刊] 华北农学报
[作者]
西廷业 王洪刚 后猛 刘海燕 刘树兵
以植物双元表达载体pCAMBIA2300-35为基础,设计带有酶切位点KpnI和XbaI的一对引物,从克隆载体pGEM-NCED1扩增到目的基因TaNCED1,酶切回收后与同样双酶切的表达载体pCAMBIA2300-35连接,获得表达载体pTaNCED1,并将所构建的载体导入根癌农杆菌GV3101菌株,为该基因的功能鉴定及通过基因工程的方法提高小麦的抗逆性奠定了基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
任清 刘光杰 郭秀林 沈世华
以p3301-BI121质粒为基础,通过中间载体pGEX-KG,构建了由CaMV35S启动子调控的PpDREB2基因植物表达载体p3301-BI121-PpDREB2,选择标记为PPT(Phosphinothricin),通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105, 为通过根癌农杆菌介导法将PpDREB2基因导入植物奠定基础。
关键词：
早熟禾 PpDREB2基因 植物表达载体
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
赵露 苑雪琪 李俊 杨雪梅 魏云洁 许永华
[目的]克隆白屈菜CmTLP基因并进行植物表达载体构建,为进一步研究CmTLP基因的功能及探索耐寒抗寒药用植物分子育种奠定基础。[方法]基于白屈菜转录组数据,分析得到白屈菜TLP基因开放阅读框,以18S RNA为内参基因,采用qRT-PCR法检测CmTLP基因在不同温度(20(CK),10,0,-7,-20℃)下白屈菜植株中的相对表达量。用RT-PCR法克隆该基因并构建植物表达载体,电击法转化根癌农杆菌。[结果]qRT-PCR结果表明,CmTLP基因在-7℃、12 h时,相对表达量最高;-7℃、24 h时,相对表达量最低。克隆白屈菜TLP基因,命名为CmTLP。该基因开放阅读框长度为696 bp,编码由231个氨基酸组成的肽链;分子质量为24.66 ku,为酸性蛋白。系统发育树表明,CmTLP基因与博落回、月季、胡桃的氨基酸序列有较高的同源性。构建了植物表达载体pRI201-AN-CmTLP,并成功转化根癌农杆菌。[结论]克隆了白屈菜CmTLP基因,构建植物表达载体pRI201-AN-CmTLP,并成功转化根癌农杆菌。
关键词：
白屈菜 植物表达载体 抗寒机理 类甜蛋白
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
冯连荣 王占斌 宋立志
为了探索山葡萄CBF3基因(VaCBF3)对杨树的遗传转化的影响,及组成型启动子和诱导型启动子对转基因植株生长的影响,分别构建由2种类型启动子调控的植物表达载体。根据GenBank上公布的rd29A基因序列设计特异性引物,利用PCR方法从拟南芥基因组DNA中克隆rd29A基因启动子片段,利用限制性内切酶通过酶切、连接构建由组成型启动子35S和诱导型启动子rd29A基因启动子驱动的VaCBF3基因植物表达载体,利用冻融法完成重组质粒对根癌农杆菌LBA4404的转化。试验结果表明,所克隆的rd29A基因启动子片段序列分析表明该启动子片段长度为945bp,与GenBank中基因序列同源性达99%,具...
[期刊] 华北农学报
[作者]
符秀梅 朱红林 周秀 李小靖 陈银华
乙烯在植物生长发育过程中发挥着重要的作用。ACC氧化酶是乙烯生物合成途径的限速酶。通过反义基因工程调控ACC氧化酶基因的表达,进而起到调控乙烯的生成是乙烯研究的主要途径。本研究采用RT-PCR方法获得番茄ACC氧化酶基因cDNA序列1 018 bp,构建该基因的正义、反义、RNA i表达载体,通过电转化法导入农杆菌LBA4404中。
关键词：
番茄 ACO基因 cDNA 表达载体构建
[期刊] 西南农业学报
[作者]
许培芳 何俊蓉 吴洁 李萍 阎文昭
成功构建了单链抗体hs83基因植物表达载体pCAMB IA1301-hs83。首先根据基因的序列重新设计了两条含有合适酶切位点的引物,酶切位点保证了基因能够插入取代pCAMB IA1301上GUS基因的第二外显子;第二步是PCR反应克隆目的基因,然后连接到pMD-18 T载体,进行测序鉴定;第三步是对pCAMB IA1301质粒和T-hs83质粒进行双酶切,释放出两个目的片段,分别回收后连接,酶切鉴定后将重组子通过冻融法转化根癌农杆菌EHA105,并用PCR法进行鉴定。
[期刊] 华北农学报
[作者]
石玉 张军科 张毅 洪晓娟 马锋旺
为了验证苹果多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因表达产物对植物病原真菌的作用,获得转基因植株,培育抗病新品种,本研究用限制性内切酶SalⅠ、BamHⅠ将已克隆的苹果PGIP基因从克隆载体pMD-18T上切下,定向插入到植物表达载体pWR306的ED35s启动子和TNOS终止子中间,成功构建了苹果PGIP基因植物表达载体pWR306-PGIP及工程农杆菌,以番茄中蔬四号叶片及茎段为受体,通过农杆菌介导法转化,获得了8株PCR检测阳性的番茄植株。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张丽华 程智慧 李霞
为了验证PR1B分泌肽对谜底蛋白的分泌和增强功能,以GUS基因为靶基因,成功构建了PR1B 和GUS融合基因的植物表达载体,通过三亲融合法转入LBA4404农杆菌,并对烟草进行了转化,在216株卡那抗 性植株中共获得2株GUS染色阳性植株。
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