RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)诱发的特异性沉默目的基因表达的过程,一种大规模制备双链RNA的方法可以便利RNAi技术的应用。以斑节对虾kazal型蛋白激酶抑制剂(KPI)基因为例,详细介绍了一种以体内载体表达大量制备dsRNA(>300nt)的方法。使用商业载体pGEMT和pDRIVE,以2步克隆法构建含有发夹环(hairpin loop)dsRNA表达载体,转化RNA酶Ⅲ缺陷的大肠杆菌HT115(DE3)进行体内转录制备dsRNA。构建的发夹RNA表达载体含有494bp的正向靶序列和403bp的反向互补靶序列,其中正向靶序列多出的91bp即可成为loop环,而无需再次克隆...

【目的】尝试自制一种价格低廉的RNA分离试剂,并检验其应用效果。【方法】以商业化的TRizolReagent为对照,使用自制RNA分离试剂提取草鱼皮肤组织总RNA,采用分光光度计法、变性琼脂糖凝胶电泳法和RT-PCR检测其品质,并用提取的总RNA合成草鱼皮肤cDNA。同时使用自制RNA分离试剂提取斑马鱼总RNA,通过RT-PCR进行E2F5基因全长(1 092bp)的克隆,构建其真核和酵母表达载体并测序。【结果】使用自制RNA分离试剂提取草鱼皮肤组织总RNA的品质与用TRizol Reagent提取的总RNA品质相当,用之成功地合成了草鱼皮肤cDNA。使用自制RNA分离试剂提取得到了更高品质的...

久期凸度方法是测度债券利率风险的一个非常有用的工具,然而,用传统的方法来计算久期和凸度,计算量非常大,对普通个人投资者来说,是难以承受的。本文提出了一种计算久期和凸度的简化方法,该方法不仅计算非常简单,而且精确度比传统方法更高。另外,用本文提出的方法计算久期和凸度,无需对收益率曲线作平坦和平行移动的假设,因而该方法更具一般性。

选取凡纳缤对虾(Litopenaeusvannamei)的4种组织(鳃、血淋巴、肝胰腺、肌肉),着重对膜蛋白的提取方法及其多肽组成进行分析。在对虾组织膜蛋白提取过程中,使用了5种蛋白酶抑制剂(苯甲基磺酰氟PMSF、胃酶抑制剂、亮抑酶肽、胰凝乳蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂),以减少组织自身的酶将蛋白降解的可能。电镜观察,可见纯度较高的、细胞膜结构卷曲形成的小泡样、封闭的结构。使用Gel Pro软件对提取产物的SDS PAGE图谱分析,确定了这几种组织的特征多肽分子量分别为75 0kD、70 5kD、26 7kD和71 2kD。

本文针对大规模定制中延迟设计的产品特点提出了基于人工神经网络的快速成本估算方法,并通过一个实例对模型进行了验证,结果表明大规模定制产品的功能特征参数与其成本之间存在非线性依赖关系,可用该模型快速有效估算大规模定制新产品成本。

为了从转录组水平研究黄伞菌的抗肿瘤等药用价值，需要提取分离得到高纯度、高质量的黄伞菌ＲＮＡ样品。利用液氮研磨ＴＲＩｚｏｌ一步法提取黄伞菌总ＲＮＡ，并且对经过和未经液氮研磨的黄伞菌ＲＮＡ提取产物进行了质量检测和统计对比分析。检测结果显示，经液氮研磨样品ＲＮＡ浓度远远高于未经研磨样品，ｏＤ２６０／２８０都约等于２，说明其纯度很高。同时，３个重复样品２５Ｓ和１８Ｓ亚基条带荧光强度比值分别为１．８，１．９，１．９，接近于２，证明ＲＮＡ完整性较好，ＡｇＩｌｅＮＴ ２１００的ＲＩＮ值检测结果分别为９．１，８．７，９．３，均远大于６．８标准，进一步佐证了其完整性。所以，液氮研磨ＴＲＩｚｏｌ一步法是非常适用于．．．

对虾白斑综合征病毒(WSSV)的囊膜蛋白在提纯的过程中易脱落,用传统的密度梯度离心方法不易获得完整的病毒粒子,对传统的蔗糖密度梯度离心方法加以改进后,可以获得大量完整的病毒粒子。用患白斑综合征病毒病的中国对虾鳃制备WSSV粗提液,感染螯虾(Cambarus proclarkii),选取25%的蔗糖溶液用作病虾鳃的匀浆液,然后经蔗糖密度梯度离心,分取各带负染后电镜观察,大量完整的病毒位于46%~52%蔗糖梯度之间,病毒粒子末端带有很长的尾;而病毒裸露的核衣壳位于40%~46%蔗糖梯度之间;在57%~62%之间观察到较多完整病毒粒子和少量细菌。实验结果表明改进的病毒提纯方法较好,可得到大量完整的带...

基于生产长形刨花的设备价格昂贵,提出一种实验用长形刨花的简易制备方法。以杉木Cuninghamia lanceolata生材为原料,采用平刨法和压刨法制备长形刨花,并对刨花尺寸和形态进行分析。结果表明:平刨法刨切的70 mm长圆木段的刨花长度为60-80 mm的占70%左右,压刨法刨切的90 mm长的方材的刨花长度为80-100 mm的约占55%;长度为70mm的刨花的形态系数约半数为100-150,90 mm长的刨花形态系数约半数为200-300。因此2种方法所制得的刨花尺寸、形态系数等都符合实验要求,取适当长度的木块及调节合适的刀片伸出量即可生产各种规格的刨花。图7参8

光合成细菌(Photo Synthetioc Ba-cteria),是一类分布于江河、湖泊、海洋中,可在人工培养条件下迅速繁殖的微生物,由于其具有较强的利用水体中低级有机物的特性,其菌体富含蛋白质、维生素,生物素等动植物所不可缺少的营养成份的优点,因此是净化水质和作为饲料添加剂的理想材料。为了探索光合成细菌在斑节对虾育

大规模定制作为一种新兴的生产模式是很多制造企业努力的方向,但是在其具体实施过程中,制造企业面临多方面的难题,其中生产调度系统就是其中一个重要的方面,本文中基于定制点分离思想对大规模定制调度问题进行了研究,提出了其生产调度问题可以概括为基于作业族和JIT的零件加工调度和物料约束下的产品组装生产调度问题,在此基础上本文给出了这两类问题进行了数学建模研究,对今后进一步研究和实践该生产调度问题具有一定的借鉴意义。

大国的经济发展具有独特的优势，其拥有的超大规模市场可以成为经济发展的战略资源。像中国这样的发展中大国所具有的超大规模市场既可以为我所用，也可能为竞争对手所用，特别是在开放条件下的辩证利用需要深入探讨。超大规模市场优势的发挥并不是外生给定的，而是需要国家内生的创造。本文对超大规模市场优势的概念进行学理辨析和界定，在此基础上论证其作为一种国家推动经济发展的战略资源，对其辩证利用的三重意涵进行阐释：一是超大规模市场利用种类繁多的市场节点培育消费需求，促进内部分工深化，通过产业间的互为供求培育本土企业的创新能力；二是超大规模市场亦可使本土企业倚仗巨大的市场规模而产生懈怠心理，削弱企业家精神；三是超大规模市场如果被外国企业利用，则会阻碍本土企业的创新与发展。因此，发挥好中国超大规模市场优势，需要充分发挥消费者的力量，同时也要积极培育具有全球竞争力的本土企业并制定符合中国国情的对外开放战略。

【目的】双链RNA降解酶(dsRNA degrading enzyme, dsRNase)是制约RNA干扰(RNAi)技术在害虫防治中应用的关键因素之一。本研究旨在利用原核表达系统获得飞蝗LmdsRNase2和LmdsRNase3的特异抗原,进而制备抗体,对其进行组织定位和蛋白表达量检测,为进一步解析飞蝗中肠dsRNA降解酶基因的功能分化提供蛋白水平的证据。【方法】通过对LmdsRNase2和LmdsRNase3的氨基酸序列(GenBank:ARW74135.1和ARW74134.1)进行比对,分别选取特异的LmdsRNase2和LmdsRNase3抗原序列(R2’、R3’)进行后续的研究。根据LmdsRNase2和LmdsRNase3的cDNA全长序列,设计包含酶切位点BamH I、Hind Ⅲ的引物,采用PCR技术扩增目标片段,双酶切后连接至pET-32a载体。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,加入IPTG至终浓度为0.5mmol·L~(-1),37℃下诱导4 h后提取蛋白,采用SDS-PAGE电泳方法检测蛋白表达。大量培养带重组质粒的大肠杆菌,诱导目的蛋白大量表达,用镍柱亲和层析法分离R2’和R3’蛋白,Bradford法检测蛋白浓度。经两次免疫新西兰大白兔后,最终获得LmdsRNase2和LmdsRNase3的多克隆抗体。利用ELISA法测定多克隆抗体的效价,通过Western blot检测抗体的特异性。提取飞蝗5龄第3天的中肠组织蛋白和中肠液,分别用LmdsRNase2和LmdsRNase3的抗体检测其表达量。最后制备飞蝗5龄第3天的中肠石蜡切片,通过免疫组化对LmdsRNase2和LmdsRNase3蛋白进行亚细胞定位。【结果】通过氨基酸序列比对发现,LmdsRNase2和LmdsRNase3具有37%的序列一致度,选取特异的序列R2’和R3’设计引物,分别包含157和153个氨基酸残基,理论分子量分别为17.0和16.8 kD。在IPTG浓度为0.5 mmol·L~(-1)条件下,37℃诱导4 h后,目的蛋白在包涵体中大量表达。扩大培养重组菌株后提取蛋白,用镍亲和层析柱分离得到纯度为85%的R2’蛋白,可直接用于免疫;而R3’蛋白的纯度低于85%,利用电泳切胶纯化后免疫新西兰大白兔,36 d后取抗血清进行检测,效价均达到1:102 400,表明抗体效果良好。用多克隆抗体杂交实验室保存的His-LmdsRNase2和His-LmdsRNase3融合蛋白,对抗体进行特异性检测,结果表明R2和R3的抗体分别特异性识别LmdsRNase2和LmdsRNase3,无交叉杂交现象,且条带与His抗体杂交到的条带大小一致。采用Western blot方法检测,发现LmdsRNase2蛋白在中肠组织中高表达,但在中肠液中未检测到可见表达,LmdsRNase3蛋白在中肠组织和中肠液中均未检测到表达。进一步采用免疫组化方法对两个蛋白进行组织定位,发现LmdsRNase2和LmdsRNase3均在中肠细胞质中表达,但LmdsRNae3的表达量较低。【结论】成功制备了特异性良好的飞蝗LmdsRNase2和LmdsRNase3抗体,Western blot和免疫组化分析表明LmdsRNase2在中肠细胞质中高表达,而LmdsRNase3的表达量很低。研究结果为飞蝗中肠两个dsRNA降解酶LmdsRNase2和LmdsRNase3的功能分化提供了蛋白水平的证据。

本研究分别以壳聚糖浓度、乳化剂用量和三聚磷酸钠用量为指标进行单因素试验,以粒径、PDI和Zeta电位为指标进行分析,制备壳聚糖-柑橘精油微胶囊。以挥发性盐基氮(TVB-N)值、SDS-PAGE电泳、硫代巴比妥酸值(TBA)和菌落总数(TVC)为指标分析壳聚糖-柑橘精油微胶囊在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)4℃贮藏过程中对其品质的影响。结果显示,与对照组相比,壳聚糖-柑橘精油微胶囊处理组可以明显抑制TVB-N值、TBA值和TVC值增长(P

介绍了一种适合PCR的水稻基因组DNA的简易制备方法。将少量(1~20 mg)水稻叶片置于1.5 mL离心管中,用转速为3 500~4 000 r/min的电钻快速(约10 s)研磨后,加提取液50~100μL,经100℃水浴10~15 min,短暂离心后即可直接取上清液作DNA模板进行PCR分析。该方法具有水浴时间短、可不加液氮研磨、对植株生育期要求不严、成本低、操作简便等优点,每人每天可完成400份以上DNA样品的简易制备,适合幼苗期大规模DNA分子标记辅助选择的PCR检测。

为了更好地研究对虾白斑综合征病毒(WSSV)蛋白VP19在WSSV感染过程中的作用,利用VP19的单克隆抗体直接对VP19进行了定位。从患白斑综合征的中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)鳃丝中提取WSSV,将提纯的WSSV经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,然后洗脱提纯其病毒蛋白VP19并免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合,用间接免疫荧光技术(IFAT)和Western-Blot技术筛选出1株阳性杂交瘤细胞,将检测出的阳性杂交瘤细胞经有限稀释法克隆,研制出抗VP19的单抗,再利用免疫胶体金技术对病毒蛋白VP19进行定位,结...