基因瞬时表达是研究目标基因功能的快速、有效手段，在植物领域得到了广泛应用。为了使学生充分了解基因工程技术在植物次级代谢物研究中的应用，实现科研反哺教学，设计了植物基因瞬时表达并影响其次级代谢物质积累的综合实验。选取非模式植物莲（Nelumbo nucifera）转录因子NnWRKY70和NnMYB5为研究对象，运用分子克隆技术构建双元表达载体。利用农杆菌注射法将目标基因导入莲花瓣中实现瞬时转化，发现过表达NnWRKY70和Nn MYB5能促进莲生物碱的合成以及花瓣花青素的积累。该实验是对以往植物生物学及生理学实验内容的扩充，有利于培养和提高学生的科研思维和实践创新能力。

采用根癌农杆菌感染半夏无菌叶片、叶柄和愈伤组织,对GUS基因的瞬间表达进行研究,并分析了不同转化受体、感染时间、菌液浓度、共培养、预培养时间、菌种对GUS基因的瞬间表达的影响。结果显示,以半夏的无菌苗叶柄和愈伤组织,在OD值为0.2的EHA101或EHA105农杆菌液中感染15 min,叶柄暗处共培养3 d,愈伤组织2 d,能够得到较高的GUS基因瞬间表达。

［目的］本研究对一个具有植物细胞死亡抑制活性的大豆疫霉效应因子Ｐｓ ＣＲＮ１２７进行功能分析，为认识疫霉菌的致病机制和利用效应因子来提高植物抗病性提供参考。［方法］利用农杆菌介导的瞬时表达技术，分析Ｐｓ ＣＲＮ１２７的细胞死亡调控活性；利用寄生疫霉游动孢子接种本氏烟离体叶片评估Ｐｓ ＣＲＮ１２７对植物防卫反应的影响；利用实时定量ＲＴ－ＰＣＲ检测本氏烟中激素抗病信号途径标记基因的表达；利用ＤＡＢ染色检测本氏烟接种叶片中过氧化氢的积累；利用与ＧＦＰ融合的方法观察Ｐｓ ＣＲＮ１２７的亚细胞定位。［结果］在本氏烟中表达Ｐｓ ＣＲＮ１２７可以抑制由ＩＮＦ１、Ｐｓｏｊ ＮＩＰ、Ｐｓ ＣＲＮ６３、ＢＡｘ和Ａ．．．

利用简并引物RT-PCR,克隆复叶槭FtsZ基因的cDNA序列,利用马铃薯X组病毒载体pgR107,构建RNA干扰重组病毒载体pVX-AnFtsZi,并转化农杆菌GV3101(含辅助质粒pJIC Sa-rep)侵染烟草。40 d后,检测烟草内源FtsZ基因的表达量。研究结果表明:从复叶槭中克隆到的569bpFtsZ基因cDNA片段,具有FtsZ蛋白的核心功能序列GGGTGSG。构建的hpRNA型RNA干扰载体抑制了FtsZ基因的表达。为培育槭树类彩叶新品种奠定分子理论基础。

为构建CHX-GFP融合基因并将其在胡萝卜愈伤组织中瞬时表达。采用融合PCR方法,将属于CAP2家族的Na+/H+反向转运蛋白基因CHX和GFP基因相融合,利用中间载体,采用DNA重组技术将CHX-GFP融合基因插入到p1301植物表达载体中,采用冻融法将重组质粒导入到农杆菌中,遗传转化时所用侵染液为1/2MS+AS 100μmol/L,共培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+琼脂6 g/L+蔗糖30 g/L+葡萄糖10 g/L+AS 50μmol/L,共培养时间为4 d。成功构建了p1301-35S-CHX-GFP-Nos植物表达载体,CHX-GFP融合基因...

[目的]本研究克隆了水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.)CUC1基因,分析其表达特性,为该基因在水曲柳再生的调控研究中奠定基础。[方法]从水曲柳苗克隆FmCUC1基因,利用生物信息学软件分析FmCUC1基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列,并构建系统进化树;利用农杆菌介导法将FmCUC1基因转入洋葱内表皮细胞进行亚细胞定位,通过实时荧光定量分析FmCUC1基因在根、茎、叶、顶芽的组织表达特异性及FmCUC1基因在下胚轴芽再生与种子萌发过程中的差异表达;同时对水曲柳幼苗喷施IAA、6-BA、BR激素处理,分析FmCUC1基因在不同激素信号诱导下的表达模式;利用农杆菌介导法将FmCUC1基因瞬时转化水曲柳72 h后,分析其通路相关基因表达情况。[结果]克隆得到FmCUC1基因全长807 bp,编码269个氨基酸,FmCUC1为稳定疏水蛋白,含有保守的NAC-domain蛋白结构域;FmCUC1蛋白与同科的木犀榄蛋白序列相似性为86.17%,亲缘关系较近;FmCUC1蛋白定位于细胞核上。qRT-PCR分析表明:FmCUC1基因在水曲柳的顶芽中表达量最高;在下胚轴芽再生过程中,FmCUC1基因在芽点产生与丛枝形成期均高表达;在水曲柳种子萌发过程中,FmCUC1基因分别在第4天和第8天分别达到两个峰值,为第0天的8.56倍和8.46倍。外源喷施IAA、6-BA、BR激素处理结果显示,FmCUC1基因表达量与对照相比均呈现上调表达,在IAA、BR处理72 h后均达到最高值,分别为对照的45.72倍和20.36倍;在6-BA处理48 h达到峰值,为对照59.40倍。利用农杆菌介导水曲柳FmCUC1基因瞬时过表达72 h后,该基因表达量显著上调,且其下游STM基因的表达量也明显上升。[结论]FmCUC1基因属于NAC家族转录因子,参与水曲柳芽再生过程,响应了IAA、6-BA、BR植物激素信号诱导,过表达FmCUC1基因可激活其下游STM基因的表达,进而有利于顶端分生组织的形成;为进一步研究CUC1基因在水曲柳芽再生过程中的作用机制奠定基础,也为今后水曲柳转基因工作提供新思路。

用高压氦气式基因枪将CaMV35S启动子驱动下的gus基因导入经济植物番红花的叶鞘和叶、芽来源的愈伤组织块中 ,4 8h后染色检测到了gus基因的瞬间表达 ,2 0d后仍检测到极少量表达 .研究发现 ,轰击前在加有 0 5mol L甘露醇的液体愈伤组织继代培养基上处理 6h ,明显增加了gus基因表达的数量 ;选择 110 0psi× 9cm的轰击条件 ,转化效果最好 ;高浓度卡那霉素 (5 0 0～ 80 0mg L)可以作为筛选剂 .结果表明 ,基因枪法是有效的番红花遗传转化方法 ,gus基因可以作为番红花基因工程研究的报告基因 ,CaMV35S启动子能有效驱动外源基因在番红花组织中表达

【目的】医学方面的大量研究证实,聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)作为一种新型阳离子多聚物基因载体可以吸附和浓缩DNA,通过与细胞膜亲和粘附和细胞吞噬作用运载外源基因进入细胞并实现表达。本实验研究旨在探索PEI作为非病毒基因载体介导外源基因进入植物细胞并获得瞬时表达的可能性。【方法】制备PEI/DNA复合物,利用凝胶阻滞分析PEI与DNA的结合情况,采用电子显微镜观察PEI/DNA复合物的形态。以绿色荧光蛋白基因为报告基因研究不同N/P比条件下PEI/DNA复合物对拟南芥原生质体细胞的转化效率,并与PEG转化方法进行比较分析。【结果】PEI与DNA的质量比为5﹕1～1﹕4,...

通过挖掘辣椒疫霉中的外泌蛋白激发子elicitins的基因序列,分析其转录特征,克隆基因序列并进行瞬时表达,以阐明其在辣椒疫霉生长发育和侵染过程中的作用。本研究利用转录组测序结果和致病疫霉INF1序列作为比对序列,对辣椒疫霉基因组数据库进行elicitins序列挖掘。采用RT-PCR方法分析elicitins基因在辣椒疫霉生长发育(菌丝、游动孢子囊、游动孢子、萌发的休止孢)和侵染寄主阶段(本氏烟灌根1.5、3、6、12、24、36和72 h后)的转录水平。克隆elicitins基因序列,并与其他卵菌的elicitins进行序列比对,分析进化关系。在本氏烟上进行elicitins的瞬时表达分析。...

利用生长素响应原件(DR5)构建了DR5::GUS报告基因表达载体,并在载体构建时,对GUS的5′UTR序列进行2种设计:一种是利用载体GUS基因原有的5′UTR构建成pBI121-DR5::GUS;另一种采用植物增强表达的常用原件烟草花叶病毒(TMV)的5′端序列(Ω′)替换GUS基因原有的5′UTR序列,构建成pBI121-DR5(Ω′)::GUS。将2种载体转化根癌农杆菌后,采用烟草叶片注射浸染的瞬时表达检测法对2个载体的植物表达效果进行检测,2种载体分别转化烟草叶片2 d后,对浸染的叶盘进行GUS染色分析,pBI121-DR5::GUS的转化叶片有明显的GUS反应,而pBI121-DR...

设计了一个顺式元件功能检测载体pYF3553,该载体以GUS为报告基因,其上游连接一段由待测香菇(Lentinula edodes)克隆片段与酵母Cyc1基本启动子组成的杂合启动子。将编号为XG108和XG111的香菇克隆序列构建的检测载体命名为pXG108p、XG111。将pXG108转化到香菇原生质体中,结果被测样的GUS瞬时活性比对照增加一倍,表明GUS基因得到了表达,其上游调控元件具有调控功能。对比pXG108和pXG111转化后的表达结果,其GUS瞬时表达活性表现出差异,这种差异与克隆片段在酵母中的表达差异相一致。分析了利用GUS瞬时表达验证未知香菇顺式元件的优缺点。

该研究通过PCR扩增、酶切及连接等分子生物学研究方法分别将β--葡萄糖苷酶基因(gusA)和绿色荧光蛋白基因(gfp)与双向启动子两端融合,构建成双可视报告基因融合双向启动子的植物二元表达载体pBDGG.通过农杆菌介导的叶盘法转化毛白杨叶片以鉴定所构建的双向启动子的功能.对农杆菌侵染3~4 d的毛白杨同一叶片进行GUS组织化学染色检测和紫外激发后通过荧光显微镜观测绿色荧光,结果表明gusA基因和gfp基因都能够进行瞬时表达,表明该双向启动子可在毛白杨中实现双向表达.该文还讨论了双向启动子在植物基因工程中应用的可能性,为实现植物基因工程的“一箭双星”(即一个启动子同时双向表达两个或多个基因)奠定...

应用PCR扩增出新城疫病毒F基因,将其克隆入pGEM-T载体,测序。然后将NDVF基因与高效的真核表达载体pcDNA4/HisMax相连,构建NDVF基因重组真核表达质粒pc4F,采用Superfect转染试剂将pc4F瞬时转染COS-7细胞,应用细胞免疫组化法检测其在细胞中的表达情况。结果表明,F基因能够在COS-7细胞中成功表达。

根据GenBank中植物病原物诱导型启动子碱基序列设计引物,以烟草基因组DNA为模板,扩增PPP3启动子。用PPP3替换pCAMBIA1301中与gus基因相连的35S启动子,构建重组质粒pCOMBIA+PPP3+gus后导入农杆菌GV3101。通过农杆菌介导的瞬时表达技术将受PPPs控制的gus基因导入烟草。分别接种青枯菌和水杨酸24 h后,烟草叶片中检测到gus基因转录效率分别提高了27.94,17.69倍。表明PPP3启动子具有本底表达水平低、诱导表达活性强的特点。

为建立一套稳定高效的小麦叶肉细胞原生质体制备技术流程，以小麦幼苗叶片为材料，采用正交和随机设计试验分析了影响小麦叶肉细胞原生质体产量的制备因素。结果发现，酶解条件相关因素对制备原生质体产量的影响由大到小依次为酶解液甘露醇浓度、纤维素酶浓度、酶解时间和离析酶浓度；甘露醇浓度和纤维素酶浓度对原生质体产量的增长表现相互促进模式，延长酶解时间情况下低纤维素酶浓度产出的原生质体较高纤维素酶浓度破碎情况少，峰值过后的产量下降慢。研究还发现取材幼苗苗龄、光照条件和取材叶位等因素对原生质体产量也有影响。综合以上结果确定了一套优化的参数组合：以黑暗培养条件下的１０ ｄ苗龄小麦幼苗第２片真叶为材料，酶解液中的纤维．．．