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[期刊] 水产学报
[作者]
李新雨 陈广宁 申晶晶 陈环环 薛长湖 常耀光
岩藻聚糖是一种具有良好应用潜力的多糖，具备多种生理活性。内切-1,3-岩藻聚糖酶是岩藻寡糖制备的关键工具。然而，作用方式清晰的食品工业用岩藻聚糖酶的缺乏阻碍了该类酶的应用。本研究旨在获得来源于GH174家族的食品工业用内切-1,3-岩藻聚糖酶Fun174Sb，并探究其作用方式。利用乳酸菌表达系统实现了一种内切-1,3-岩藻聚糖酶Fun174Sb的异源表达。结果显示，Fun174Sb对于来源于土耳其刺参的岩藻聚糖（Ht-FUC）具有降解能力，酶活性为1.90 U/mg。该酶在35～50°C、pH 7.5～8.5条件下显示出较高的活性，且具有良好的温度稳定性及pH稳定性。通过超高效凝胶排阻色谱串联质谱以及核磁共振技术阐明了Fun174Sb的酶解产物中主要寡糖的结构，从而推断出Fun174Sb切割HtFUC的Fucp2（OSO3-）与Fucp2,4（OSO3-）之间的α-1,3-糖苷键。研究表明，乳酸菌表达的Fun174Sb具有良好的生化性质以及清晰的作用方式。本研究为作用方式清晰的食品级岩藻聚糖的应用奠定基础。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
黄君 张昌毅 赵述淼 梁运祥
利用RT-PCR技术,提取黑曲霉(Aspergillusniger)L3的总RNA进行反转录,并通过PCR扩增得到去除天然信号肽的β-1,4-葡聚糖酶基因egⅠ,将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,使之位于α-因子信号肽下游,并与之同框,构建重组表达质粒pPIC9k-egⅠ,电击转化毕赤酵母GS115,经MM、MD、CMC-Na和G418平板筛选,得到重组毕赤酵母工程菌1#和5#,在摇瓶中β-1,4-葡聚糖酶酶活分别达到1456U/mL和1928U/mL。重组酶最适温度为70℃,最适pH为5.0。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
孟祥宇 张艳丽 霍忠明 牟政强 王化敏 闫喜武
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
朱泾 赵述淼 彭楠 梁运祥
利用PCR技术从冰岛硫化叶菌(Sulfolobus islandicus)REY15A中分别扩增得到带有和不带有信号肽编码序列的β-1,4-内切葡聚糖酶基因(S.islandicus eng),将其克隆至硫化叶菌表达载体pZC2中,构建重组表达载体pZC2-eng-YS和pZC2-eng-WS,并转化至S.islandicus E233S(△pyrEF△lacS)。重组菌株经D-阿拉伯糖诱导后,细胞破碎上清经镍离子金属鳌合亲和层析介质(Ni-NTA)柱纯化,得到重组蛋白。SDS-PAGE结果表明:不带有信号肽的葡聚糖酶(ENG-W)分子质量为41ku,带有信号肽的分子质量(ENG-SP)为43...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
徐顺清 陈杏洲 崔罗生 梁运祥 张忠明
通过PCR扩增从乳酸克鲁维酵母基因组获得乳糖酶基因lac4,将其克隆至大肠杆菌表达载体pET-28a(+),并在大肠杆菌BL21中获得表达,酶活性达(44.78±2.84)U/mL。利用Ni-ResinHP亲和层析技术纯化该酶,SDS-PAGE分析表明,重组酶分子质量约为122ku。酶学性质研究表明,该酶最适反应温度为43℃,37℃时半衰期为30min,最适反应pH为7.0,在pH4.0～10.0范围内有良好的稳定性,Ca2+、Zn2+、Fe2+、Co2+、Mg2+、Mn2+对酶有非常明显的激活作用,比酶活性为(255.55±2.32)U/mg,酶反应常数Km为3.49mmol/L,最大反应速...
[期刊] 华北农学报
[作者]
李琦 成莉凤 段盛文 冯湘沅 郑科 杨琦 刘志远 彭源德
为了获得新型木聚糖酶的高效分泌表达,在工程酶项目组前期原核表达了木聚糖酶基因xyn A的基础上,将xyn A基因(Gen Bank登录号:U57819)编码耐热性木聚糖酶成熟蛋白的部分序列克隆到p PICZαA表达载体上,转化毕赤酵母X33,成功构建真核表达体系,再分批加入0. 5%(V/V)甲醇诱导毕赤酵母工程菌株产胞外木聚糖酶。结合木聚糖酶活力检测、SDS-PAGE电泳和Western Blot分析胞外木聚糖酶表达情况。结果表明,该XynA含有典型的糖苷水解酶11类催化结构域(GH11),成熟蛋白的预测分子量为38. 6 ku,等电点为6. 86; 7个毕赤酵母基因工程菌株X33/p PICZαA-xyn A分泌的木聚糖酶活力均≥300 U/m L,最高达487. 2 U/m L;胞外木聚糖酶在SDS-PAGE和Western Blot检测的特征谱带分子量约为45 ku,均比预期分子量(38. 6 ku)略大。一种新型木聚糖酶获得了高效分泌表达,为进一步分离纯化,研究其性质、结构和功能奠定了基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘博 崔素萍 王晓杰 黄丽丽 康振生
为研究小麦与条锈菌互作过程中β-1,3-葡聚糖酶基因的功能,根据小麦β-1,3-葡聚糖酶cDNA全长序列设计合成引物,通过RT-PCR方法获得小麦β-1,3-葡聚糖酶基因编码区,将其克隆至pGEM T-easy Vector,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切回收目的片断,并将其定向克隆到pET-32a(+)Vector中构建表达载体GLU-pET-32a(+),转化E.coliBL21(DE3),用IPTG进行诱导表达。结果表明,小麦β-1,3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中得到了高效表达,获得了分子量约为49 ku的融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的19%。最佳诱导条件为:0.3 mmol/LIPTG...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
栗小英 高琳 张艳俊 王海燕 刘大群
【目的】β-1,3-葡聚糖酶是一种病程相关(pathogenesis-related,PR)蛋白,了解小麦TcLr35中β-1,3-葡聚糖酶基因在叶锈菌(Puccinia triticina)与TcLr35小麦互作体系中的表达模式,明确其与TcLr35小麦抗叶锈病相关性,进而探讨PR蛋白介导的小麦成株抗叶锈病的分子机理。【方法】在前期研究基础上,利用生物信息学方法分析已克隆β-1,3-葡聚糖酶类病程相关蛋白基因TaLr35PR2结构特征,利用半定量RT-PCR方法结合genetools和SPSS软件检测叶锈菌及信号分子诱导后不同时间点该基因表达量,并明确其在小麦根、茎和叶各生长器官及小麦不同生...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
徐伟佳 韩卫杰 李旺 陈玉林
【目的】研究陕南地区桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶基因,为构建高效分解纤维素的工程菌奠定基础。【方法】用质量分数为1%的羟甲基纤维素钠(CMC-Na)测定桑天牛幼虫内切β-1,4-葡聚糖酶活性,Trizol法提取桑天牛肠道总mRNA,扩增其内切β-1,4-葡聚糖酶基因,用DNAStar和NCBI上的BLAST进行序列分析。根据测序得到的基因序列设计1对引物,扩增桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶基因CDs区,构建原核表达载体pET-APEG,并在大肠杆菌中表达。【结果】桑天牛内切β-1,4-葡聚糖酶最适pH为4.4~5.6,pH值为5.0时酶活性最高;最适温度为30~50℃,50℃时酶活最高;酶液...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
杨玉霞 张慧玲 汪艳 陈勇
为实现瘤胃细菌产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因(FsGLU)的高效表达,开发新的饲用β-葡聚糖酶资源,根据毕赤酵母对密码子的偏爱性、G+C含量等特点,对FsGLU基因进行密码子优化,然后合成优化后的1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因(FsGLUm),转化毕赤酵母GS115,以甲醇诱导表达并对重组FsGLUm的酶学特性、底物特异性和对消化酶的耐受性进行了研究。结果表明:摇瓶水平条件下,以甲醇诱导表达48 h时,重组FsGLUm酶活性提高25.1%(P
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
靳敏峰 侯喜林
根据其他植物的β-1,3-葡聚糖酶基因保守域序列设计简并引物,扩增出青花菜β-1,3-葡聚糖酶基因的中心区段,结合5′RACE和3′RACE技术获得该基因的5′端序列和3′端序列,经序列拼接获得1个1 277 bp的cDNA,在GenBank中登录号为EF484879,定名为BObg。序列分析结果表明,该cDNA包含1个1 056 bp的开放阅读框,编码352个氨基酸,其理论上的等电点PI=7.314,相对分子质量为3.892×104,聚类分析显示该序列与已报道的其他植物的β-1,3-葡聚糖酶基因具有较高氨基酸序列同源性。利用未接种和接种霜霉病后不同时期的青花菜植株细胞进行半定量RT-PCR分...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
唐治玉 王淮 熊善柏 王琳
为了制备β-1,3-葡聚糖酶,从土样中筛选出一株产β-1,3-葡聚糖酶活力较高的菌株LE02,经形态学观察,初步鉴定为木霉菌.木霉LE02在以2%的酵母粉为主的液体产酶培养基(起始pH 7.0)中,于32℃,150 r/min摇瓶培养60 h达到产酶高峰,酶活力可达71.09 U/mL.
关键词：
β-1,3-葡聚糖酶 筛选 产酶条件
[期刊] 林业科学
[作者]
殷幼平 王中康 曹月青 何正波
经丙酮沉淀、UltrogelAcA5 4凝胶过滤、Q Sepharose离子交换柱层析和聚丙烯酰胺凝胶制备电泳 ,发现桑粒肩天牛幼虫肠液中具有所有水解纤维素成分的三种消化酶 ,并且每种酶都有不同数目的同工酶。纯化出一种内切 - β- 1 ,4 -葡聚糖酶 (EG - 1 ) ,其分子量为 2 6ku ,等电点约为pI4 0。酶的最适反应温度为 4 5℃ ,最适反应pH为5 2 ;不耐热 ,5 0℃处理 30min ,酶活大大降低 ,70℃处理 2h ,几乎丧失全部活性 ,显示出该酶适合动物肠道反应环境 ,是内源性酶。
[期刊] 草业科学
[作者]
邹爱爱 魏亚琴 杨宇泽 曹磊 孙康永杰 万学瑞 王川
为构建高效表达的内切葡聚糖酶基因工程菌,本研究以牛瘤胃液中微生物全基因组为模板,通过PCR扩增方法得到eg片段,将其克隆至表达载体pMG36e中获得分泌型表达载体pMG36e::eg;将测序正确后的重组质粒电转导到乳酸菌(Lactococcus lactis NZ9000)中,得到L. lactis NZ9000/pMG36e::eg重组菌株,将发酵上清液通过10%三氯乙酸(Trichloroacetic acid, TCA)/丙酮沉淀法浓缩蛋白后,用刚果红染色法和3, 5-二硝基水杨酸(3, 5-Dinitrosalicylic acid, DNS)法检测该蛋白酶活性,使用滤纸酶活力(filter paper enzyme activity, FPA)法检测该蛋白酶的总酶活,并对重组内切葡聚糖酶进行酶学性质研究。结果表明:从牛瘤胃微生物中克隆得到一个基因大小为1 500 bp左右的条带,该酶分子量为50 kDa左右,经刚果红染色有明显水解圈,水解圈直径为2.32 cm;采用DNS法测定该重组蛋白的酶活为12.401 9U·mL~(-1),用FPA法测定总酶活为12.246 9 U·mL~(-1);重组蛋白酶对羧甲基纤维素钠、滤纸、微晶纤维素、脱脂棉均有酶活性;最适反应温度为90℃;最适反应pH为6;其中Cu~(2+)、Mn~(2+)、Ba~(2+)、Zn~(2+)、Co~(2+)等均可以提高重组酶的酶活力,而Fe~(2+)可抑制重组内切葡聚糖酶活力。本试验纤维素酶eg基因在L. lactis NZ9000中的稳定高效表达为提高青贮饲料的营养价值和消化率提供了技术支持。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
杨光 盛军 陈亚东 沙珍霞
构建了枯草芽孢杆菌CH_2菌株(Bacillus subtilis CH_2)壳聚糖酶基因的真核表达载体p PIC9K-CH2-Cns,在毕赤酵母GS115(Pichia pastoris)中进行重组表达,获得了有生物学活性的重组壳聚糖酶,对重组壳聚糖酶的酶学特性及酶解产物进行了分析。结果显示,重组壳聚糖酶的分子量为29 k D,粗酶的比酶活达到133.60 U/mg,纯化后重组蛋白的比酶活为338.08 U/mg;该酶的最适作用温度为50℃,最适pH为4.5,酶动力学常数Vmax=24.39(μmol/
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