【目的】禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)根据其表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸(neuraminidase,NA)的不同,可分为16种HA和9种NA亚型。根据其致病力的差异可分为高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus,LPAIV)。虽然H4亚型禽流感病毒为低致病性AIV,感染家禽表现为无症状感染,但其对禽类甚至是哺乳动物是一个潜在的威胁,因此必须要加强对H4亚型禽流感...

为了解湖北鸡源禽流感病毒的遗传进化和氨基酸变异情况,将分离到的2株禽流感病毒进行全基因组测序及遗传进化分析。利用RT-PCR扩增流感病毒基因组片段,PCR扩增流感病毒片段、克隆至pMD18-T载体,并对序列特征进行生物信息学分析。结果表明:分离到的2株病毒高度同源,其HA和NA基因属于Y280谱系,PB1、PA、NP和NS基因属于SHF98-like谱系,PB2和M基因属于G1-like谱系;HA裂解位点均为-RSSR↓GLF-,具有低致病性流感病毒的分子特征;在HA蛋白上比当前流行株Y280多了一个潜在糖基化位点313(NCS);在234位点(对应H3编号中的226)产生了从Q到L的突变;在M2蛋白的31位点均产生了从S到N的突变。该2株H9N2亚型流感病毒为Y280谱系的病毒,这提示湖北地区可能也流行Y280-like分支禽流感病毒,虽然属于低致病性禽流感病毒(Low pathogenic AIV,LPAIV),但具有感染哺乳动物的潜在风险。

［目的］本文旨在了解Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病毒神经氨酸酶（ＮＡ）基因的遗传特点和变异情况。［方法］选择２００８—２０１３年从江苏、安徽和浙江省家禽中分离的１１株Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病毒，用ＲＴ－ＰＣＲ方法对ＮＡ基因片段进行扩增、克隆和序列测定，并对其核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性及遗传进化分析。［结果］１１株毒株的ＮＡ基因核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为８６．２％～９９．５％和８６．９％～９９．１％，均属于欧亚分支。其中９株鸡源毒株属于Ｙ２８０－ｌｉｋｅ亚系，在ＮＡ蛋白颈部６３～６５位点缺失了３个氨基酸；２株鸭源毒株属于Ｇ１－ｌｉｋｅ亚系，在颈部３９～４０位点缺失了２个氨基酸。１１株分离株除．．．

为分析本实验室分离的犬副流感病毒CPIV-BJ01株全基因组序列与其遗传变异情况,对CPIV-BJ01株全长进行分段扩增并测序,拼接获得全基因组序列,与GenBank发布的27株副流感病毒5型分别进行全基因组和包膜糖蛋白(F、SH和HN)核苷酸及氨基酸序列的相似性比对,分析其遗传进化关系。结果显示,CPIV-BJ01毒株与犬源PIV5 1 168-1亲缘关系最近,核苷酸相似性为99.9%,氨基酸相似性为99.8%。CPIV-BJ01的F和HN基因序列变化较为保守,核苷酸和氨基酸变化均在4%以内,其中F蛋白的氨基酸变化形成一处新的O-糖基化位点;CPIV-BJ01株的SH基因序列与其他演化分支毒株差异显著,核苷酸相似性为84.4%～97.0%,氨基酸相似性为31.8%～95.6%。综上,CPIV-BJ01株基因组序列与前人报道的毒株相比,在F、HN基因和部分非编码区存在核苷酸或氨基酸序列的改变,同时F蛋白存在糖基化修饰的改变,均为该毒株所特有,该研究结果丰富了中国CPIV流行株的基因组信息。

【目的】了解猪流感病毒的分子流行病学,为动物流感的防控提供科学依据。【方法】将猪的鼻拭子接种鸡胚进行病毒分离,对血凝试验阳性的样品在SPF鸡胚上进一步纯化、增殖,采用RT-PCR对分离毒株的全基因组进行扩增,使用Applied Biosystems 3500x L Genetic Analyzer进行序列测定,利用DNASTAR软件对测序基因片段进行整个阅读框的核苷酸序列同源性比对分析,并用MEGA 6.0绘制遗传进化树及分析氨基酸位点。【结果】分离毒株A/swine/Zhejiang/245/2013(SW/ZJ/245/13)为H1N1亚型病毒,核苷酸的分析结果发现该分离毒株的8个基因片段...

为了阐明新疆油鸡H9亚型流感病毒PB1基因的分子特征与进化趋势,本研究采用RT-PCR技术对新疆油鸡分离株A/Chicken/Xinjiang Baicheng/1/2014(H9 N2)的PB1基因进行了克隆、测序及分子进化分析,将PB1基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列与Genbank中已经公布的参考序列进行同源性比较。结果表明,新疆油鸡分离株的PB1基因由2274个碱基组成,编码757个氨基酸,与AIV A/chicken/Henan/89/2013(H7N9)的PB1基因处于同一分支,其核苷酸和氨

【目的】了解广西H9N2亚型猪源流感病毒的分子流行病学特征并揭示其遗传变化规律,为有效防控猪流感提供参考依据。【方法】运用PCR方法扩增广西2株H9N2亚型猪源流感病毒(A/swine/Guangxi/P2/2011和A/swine/Guangxi/P3/2011)的HA基因,并进行克隆测序及序列比对分析,绘制遗传进化树。【结果】2株H9N2亚型猪流感分离株的HA基因全长1701 bp,开放阅读框(ORF)全长1683 bp,编码560个氨基酸;与参考毒株核苷酸的同源性在83.7%～98.3%,推导氨基酸同源性在86.6%～98.2%。遗传进化树分析结果显示,2株分离株与A/Duck/HongKong/Y280/97病毒同属欧亚谱系的Y280亚系,其HA基因的裂解位点序列均为RSSR↓GLF,具有低致病性流感病毒的分子生物学特征;共有8个糖基化位点,其中6个位于HAl区,2个位于HA2区;HA受体结合位点均具有人流感病毒和猪流感病毒特征。【结论】分离获得的广西2株H9N2亚型猪源流感病毒A/Swine/Guangxi/P2/2011和A/Swine/Guangxi/P3/2011,其HA基因属于欧亚普系的Y280亚系,均具备典型的低致病性和与人流感受体结合特征。

【背景】H9亚型禽流感病毒(AIV)存在宿主范围扩大、毒力增强的趋势,并为其他亚型AIV重排提供基因,给养禽业和公共卫生造成极大威胁。水禽不仅是流感病毒的宿主,更是其天然储存库,在禽流感病毒的传播和变异中发挥着重要作用。因此有效控制水禽感染对养禽业健康发展、公共卫生安全具有重要意义。鸭肠炎病毒(DEV)属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率。DEV基因组大,免疫原性好,具有开发成活疫苗载体的潜力。【目的】构建缺失gE基因、表达H9亚型AIV HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA,探讨重组病毒rDEV-△gE-HA作为防治DEV-AIV的二联重组活载体疫苗的可行性。【方法】以H9N2亚型禽流感病毒HA基因作为靶基因,构建含有HA基因表达盒的转移载体pT-gE-HA,将其与携带绿色荧光蛋白标记的重组rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞后,进行蚀斑筛选、纯化表达HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因测序鉴定重组病毒;在CEF中连续传代重组病毒20次,测定外源基因传代稳定性。以10~3 TCID_(50)免疫易感鸭,分析重组病毒rDEV-ΔgE-HA对致死性DEV强毒攻毒保护效果;将不同剂量(10~3-10~6TCID_(50))rDEV-△gE-HA免疫鸭,免疫后14、21、28 d分别采集血清,测定H9血凝抑制(HI)抗体,并在免疫后28 d,以10~8EID_(50)的剂量静脉注射H9N2AIV(A/duck/GD/08),攻毒后2 d,采集喉拭子,进行病毒分离试验。【结果】将构建的转移质粒载体pT-gE-HA与rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞,经过3轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△gE-HA。PCR鉴定及基因测序结果显示,HA基因成功地插入到DEV基因组中,替换了绿色荧光蛋白。重组病毒在CEF中至少能稳定传代20代。重组病毒rDEV-ΔgE-HA以10~3 TCID_(50)免疫易感鸭,能抵抗致死性DEV强毒攻击。重组病毒rDEV-Δg E-HA免疫易感鸭后14 d,各剂量免疫组均能检测到H9 HI抗体效价;免疫后21日,各组抗体效价水平略有上升,10~3TCID_(50)剂量免疫组HI抗体效价达到1:24,而10~4-10~6TCID_(50)剂量免疫组HI抗体效价在1:2~(2.4)-1:2~3。免疫鸭后28 d,用H9N2 AIV进行攻毒,10~3、10~4、10~6TCID_(50)免疫组均未从喉拭子分离到病毒H9N2,说明能完全保护,阻止喉头排毒,而10~5TCID_(50)免疫组保护率为80%(4/5),1/5病毒分离阳性。【结论】成功构建了稳定表达H9亚型AIV HA基因的重组DEV,该重组病毒保留了亲本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV强毒的攻击;免疫鸭后能诱导产生AIV HI抗体,尽管HI抗体滴度不高,但至少80%免疫鸭能阻止排毒。该研究为研制DEV-H9亚型AIV二联重组活载体疫苗奠定了基础。

【背景】H6亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）广泛流行于我国南方地区，是我国家禽中最常见AIV之一。H6N1亚型AIV频繁地与其他野鸟源毒株重配，并且可以作为供体为高致病性AIV提供内部基因片段，产生新型重组病毒，进而威胁人类健康。【目的】通过对我国H6N1亚型AIV的演化动态及其相关生物学特性分析研究，为我国禽流感的综合防控提供数据支持。【方法】采集2019—2022年我国25个省（直辖市、自治区）的活禽交易市场及养殖场家禽喉和泄殖腔拭子，通过接种鸡胚分离到7株H6N1亚型AIVs并对其进行全基因组测序，分析其遗传演化特征、受体结合特性及其对SPF鸡和BALB/c小鼠的感染性。【结果】遗传演化分析表明，7株病毒的基因与分离于北美及东南亚地区的野鸟源病毒基因同源性较高，基因来源复杂，具有明显的遗传多样性。贝叶斯演化分析表明，H6亚型AIV HA基因曾发生过多次的跨洲际传播，欧亚谱系病毒在北美地区也有着较长时间流行。1株病毒HA基因与北美地区毒株基因高度同源，根据贝叶斯演化分析结果，推测该病毒在野鸟体内经历了复杂的基因重配后形成，后经野鸟传入我国。特殊氨基酸位点分析结果显示，病毒HA蛋白裂解位点序列均为PQIETR↓GLF，符合低致病性AIV特征；此外，另有1株病毒的NP蛋白发生Y52H突变，据报道，该突变对AIV获得抵抗人干扰素刺激基因BTN3A3的能力起到关键作用。受体结合特性分析表明，部分毒株具有双受体结合特性，但结合人源受体能力弱于结合禽源受体能力。病毒对SPF鸡的感染性试验表明，鸡感染A/chicken/Jiangxi/S40445/2019(H6N1)后能通过呼吸道及消化道排毒，并且病毒可在鸡群内通过接触传播。鸡感染A/duck/Jiangxi/S10941/2019(H6N1)后仅有少数鸡通过呼吸道排毒，病毒无法在鸡群间通过接触传播。BALB/c小鼠的感染性试验表明，H6N1亚型AIV无需提前适应便可在小鼠呼吸道内有效复制，但对小鼠仍呈低致病力。【结论】2019—2022年分离于我国的H6N1亚型AIV基因大部分来源于野鸟源病毒，候鸟可经东亚-澳大利亚迁徙路线将病毒传入我国；部分病毒能够结合人源唾液酸受体并在小鼠呼吸道内有效复制，表明该亚型病毒对公共卫生安全构成潜在威胁。

【目的】为了验证H5N1亚型禽流感病毒对鸭是否具有致病作用。【方法】对2003年某地方养鹅场发病鹅群分离的一株H5N1亚型流感病毒A/Goose/HLJ/QFY/2003的生物学特性和致病性进行研究。【结果】动物实验表明该病毒对不仅对鸡具有高致病性(IVPI=3),而且对鸭也具有高致病性。雏鸭人工感染该病毒后临床表现典型的神经症状,剖检可见脑膜点状出血,肝脾肿大并见有坏死灶,肺脏严重充血、出血,消化道粘膜弥散性出血。病理组织学检查发现全身各脏器以出血、充血、细胞变性坏死和炎性细胞浸润为主要特征,并表现为不同程度的损伤。感染鸭死亡集中在感染后的4～6d,致死率75%。雏鸭在病毒感染后2～4d的气...

为调查我国多个省份鸡群中发生一种以眼睑肿胀出血、呼吸道症状、产蛋鸡产蛋率急性下降为特征的传染性疾病的致病病原，本研究对发病鸡群进行流行病学调查，病原分离鉴定，病毒全基因序列分析，并对分离病毒进行了动物回归试验。结果表明：1）该病自2021年12月首先发现于广东省某三黄鸡群，随后陆续在福建、安徽、江苏、河南等多个省份鸡群中发生，鸡群发病率高，后期易继发感染细菌，死亡率1%～10%;2）实验室初步诊断为H3N8亚型禽流感；3）全基因组序列分析表明，该病毒为新型禽流感病毒，系欧亚禽分支H3基因、北美禽分支N8基因与G57基因型H9N2病毒内部基因组成的三源重排病毒；4）新型H3N8病毒对SPF鸡高度易感，感染鸡表现为眼睑肿胀出血，轻微呼吸道症状；病理变化为哈德氏腺黏膜坏死，鼻甲、气管纤毛上皮细胞坏死，黏膜下层炎性细胞浸润，肺脏支气管肺炎；病毒可通过口咽和泄殖腔排毒，排毒时间为5～7d；病毒在鼻甲、气管和肺脏中可高效复制，并且可以在哈德氏腺等肺外脏器复制。综上，新型三源重排H3N8禽流感病毒对鸡高度适应，对呼吸系统致病性较强，应尽快开展系统的流行病学监测，及早对病毒的源头及传播途径进行防控，力争将这种新型病毒消灭在流行早期阶段。

【目的】验证斑鸠对H9N2亚型禽流感病毒的易感性,测定斑鸠呼吸道上皮细胞表面流感病毒受体的类型和分布。【方法】以5×104EID50/只的剂量经滴鼻、点眼途径感染A/Chicken/Beijing/2/2009(H9N2)亚型禽流感病毒,共感染8只斑鸠和8只SPF鸡,对试验斑鸠和SPF鸡进行临床症状、大体病变、组织学病变的观察及病毒抗原的定位、病毒分离和感染抗体的测定。【结果】攻毒后5d,斑鸠和SPF鸡未见异常临床表现和大体病变,病理组织学检查发现斑鸠的喉头、气管上段、中段和下段上皮细胞均有不同程度的脱落;在斑鸠的喉头、气管上段、中段和下段上皮细胞的胞浆内检测到了大量阳性流感病毒蛋白颗粒;斑鸠...

【目的】了解近年来中国H9N2亚型禽流感病毒毒力变化和抗原性变异的特点,【方法】对分离于1998—2008年间的25株H9N2亚型禽流感病毒分离株进行了EID50、ELD50、MDT、ICPI、IVPI和8周龄SPF鸡人工感染排毒试验,测定了部分分离株与抗H9N2亚型禽流感病毒Hp参考株HA蛋白单抗2A4和F6的血凝抑制(HI)和中和反应特性,对具有不同反应特性分离株的HA基因进行了序列分析。【结果】不同分离株呈现致病力差异,具多态性特征,3#、12#和14#分离株致病力偏强,能引起部分SPF鸡发病和死亡,人工感染8周龄SPF鸡排毒时间更早,排毒期更长。3#和12#分离株与单抗2A4和F6呈现...

参考GenBank上发表的H5亚型禽流感病毒(AIV)神经氨酸酶(NA)基因序列设计引物,PCR扩增NA基因,再将其克隆到原核表达载体pET-32a中,用E.coliBL21(DE3)原核表达,SDS-PAGE和Western-blot对表达蛋白进行鉴定。Western-blot结果表明,表达产物具有免疫学活性,蛋白的分子量约为61 kDa,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理,表达蛋白能与H5亚型AIV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV神经氨酸酶抗体具有良好的灵敏性。

参考GenBank上H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计引物,PCR扩增NP基因,对其进行序列分析并构建分子进化树。将克隆的NP基因插入原核表达载体pET32a,在大肠杆菌中进行诱导表达,对诱导表达的NP重组蛋白进行纯化、Western-Blot鉴定及免疫原性分析。结果表明,克隆的NP基因与GenBank上发表的另外2个河南AIV毒株亲缘关系较近,诱导表达的NP重组蛋白主要以可溶性形式存在,分子量约为70 kDa,并且能够与H5亚型AIV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。