[目的]2017年以来,在中国东部地区的许多鹅场中,4—16日龄雏鹅暴发了严重的痛风,导致2%～20%的死亡率,给养鹅场带来巨大经济损失,本试验旨在分离、鉴定导致此次雏鹅痛风的病原并分析其生物学特性。[方法]将发病雏鹅病料接种10日龄鹅胚,分离病毒,通过PCR、基因测序和系统进化分析对分离的病毒进行鉴定;病毒尿囊液接种鹅肾脏上皮细胞测定病毒滴度;攻毒扬州白鹅雏鹅进行动物回归实验,观察剖检和组织病理变化,PCR方法检测肛拭子和各脏器病毒含量,ELISA方法检测血清中尿酸含量。[结果]从第3代鹅胚尿囊液中分离到一株鹅星状病毒(GAstV),命名为JSHA株。对星状病毒ORF2基因氨基酸进化树的分析结果表明,JSHA毒株与2018年从患痛风的鹅上分离得到的星状病毒毒株(SD01、SDPY、GD)具有99%以上的同源性,而与其他禽星状病毒同源性仅为27.3%～57.0%。阳性尿囊液感染鹅胚肾脏上皮细胞后出现变圆、聚团和脱落等细胞病变,病毒滴度为10~(4.25) TCID_(50)·mL~(-1)。动物回归实验结果显示,该病毒可致雏鹅25%的死亡率,发病鹅体质量减轻、肾脏发白肿胀、脏器表面和关节腔内尿酸盐沉积以及血清尿酸升高;组织病变表现为肾小管上皮细胞变性坏死,尿酸盐结晶形成,大量炎性细胞浸润,肝脏和脾脏中出现坏死区和炎性细胞浸润;组织病毒载量结果显示肾脏、肝脏和脾脏的病毒载量高于其他组织;雏鹅从感染后3 d开始排毒,排毒高峰出现在6～9 d。[结论]鹅星状病毒JSHA毒株是此次雏鹅发生痛风的主要原因。

【目的】从疑似感染鹅呼肠孤病毒的病料中分离鉴定一株鹅源呼肠孤病毒JS-01,并对病毒分离株的致病性进行初步研究,为开展该病毒的进一步研究奠定基础。【方法】取病死鹅的肝、脾组织冻融3次后充分匀浆,8 000r/min离心15min取上清,接种10日龄鹅胚的卵黄囊,收集24144h死亡的鹅胚尿囊液,并提取病毒RNA。根据鹅呼肠孤病毒基因的保守序列设计特异性引物,利用该引物对所提取的病毒RNA进行RT-PCR,回收后与pMD18-T载体连接,将重组载体转化到DH5α大肠杆菌并在AMP+/LB培养基中培养,对阳性

筛胸梳爪叩甲(Melanotus cribricollis)是浙江笋用林内昆虫的优势种群,其幼虫(即金针虫)是笋期主要害虫之一,在湖州市的德清和安吉、杭州市的余杭和临安等重要竹区的早园竹(Phyllostachys praecox)林中,鲜笋带虫率可达62%,种笋受害率更是高达80%以上,严重制约了当地竹产业的健康发展(徐天森,2004)。由于金针虫营地下生活,防治一直是竹笋生产管理的难点。化学防治会导致竹笋

从发病桑椹上分离纯化出一株真菌,对其进行形态学、分子生物学鉴定,此菌株为一种桑椹致病菌,为桑茎点霉Phomam oricola。对该菌株的生物学特性研究发现,菌株在多种培养基上均可以生长,在PDA和燕麦培养基生长最适合;适合温度为18~23℃,最适pH值为6,最适碳、氮源为淀粉和NaNO3。

【目的】鸭瘟和小鹅瘟是番鸭和鹅的两种重要传染病，鸭瘟最主要的防治措施是定期接种鸭瘟病毒减毒活疫苗。根据２０１２年国际病毒分类委员会（ＩＣＴＶ）的报告，ＤＥＶ被归为疱疹病毒科的α疱疹病毒亚科马立克氏病毒属。疱疹病毒如伪狂犬病毒、马立克氏病毒、火鸡疱疹病毒等已广泛用于病毒活载体的研究，而近几年也有关于鸭瘟病毒（ＤＥＶ）作为疫苗活载体的报道。为了为免疫防控鸭瘟和小鹅瘟提供新手段，本研究拟在鸭瘟病毒疫苗株感染性克隆的基础上，构建表达小鹅瘟病毒（ＧＰＶ）主要免疫原蛋白ＶＰ２的重组病毒ｒＤＥＶ－ＶＰ２，并研究其生物学特性，进而探讨重组病毒ｒＤＥＶ－ＶＰ２作为防治ＤＥＶ和ＧＰＶ的二联重组活载体疫苗的可能性。．．．

为研究Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)不同分离株毒力强弱及生物学特性的差异,该研究从患病和健康草鱼体内分离到Ⅱ型GCRV各一株,分别命名为ZH180804和CQ180701,并从细胞培养特性、致病性、基因组带型、基因序列差异、遗传进化关系等方面进行比较分析。结果显示,ZH180804对草鱼和稀有鲫的致死率分别为80%和100%, CQ180701对草鱼和稀有鲫的致死率分别为0和10%,初步表明ZH180804为强毒株,CQ180701为弱毒株,且弱毒株感染过的草鱼对强毒株的攻击感染具有较好的免疫保护;2株分离株在草鱼鳔细胞(GSB)、稀有鲫卵细胞(GRE)及稀有鲫尾鳍细胞(GRF)中均能增殖但不产生致细胞病变效应(CPE),且ZH180804株的增殖量是CQ180701株的1 000倍以上;十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,2株分离株基因组带型相似,但S7、S8、S9、S10与S11节段的分布存在一定的差异;2株病毒的S7与S11节段的基因序列同源性分别为98%和99%。基于S7与S11节段编码的氨基酸序列构建的遗传进化树显示,2株分离株聚在同一个分支上,具有较近的亲缘关系。研究表明,从患病和健康的草鱼中分离的2株Ⅱ型GCRV有较多共性,但其复制能力、致病性等方面存在较大差异。

从河南省有呼吸道症状的5个不同猪场采集棉拭子和肺组织样品。样品处理后,通过尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚。获得3株病毒,经血凝和血凝抑制试验鉴定,为H3N2亚型流感病毒,并对其部分生物学特性进行了研究。结果表明,其半数鸡胚感染量(EID50)分别是0-9.56/0.2mL,10-8.56/0.2mL和10-8.44/0.2mL,对小白鼠的半数致死量(LD50)分别是10-1.56/0.1mL,10-1.45/0.1mL和10-1.50/0.1mL;它们的血凝素对热不稳定,能凝集1%马、牛、驴、猪、绵羊、鸡、兔、豚鼠、小白鼠及人O型血的红细胞。这为了解河南猪群中流行的流感病毒奠定了基础。

[目的]本研究旨在制备抗鹅星状病毒（goose astrovirus，GAstV）单克隆抗体，并鉴定其识别的抗原表位，为快速检测GAstV感染和研究P2蛋白的结构与功能奠定基础。[方法]通过原核表达系统表达并纯化GAstV-2 P2蛋白，将其做为免疫原免疫六周龄BALB/c雌鼠，利用杂交瘤技术，经过细胞筛选和亚克隆，获得3株能稳定分泌抗P2蛋白的单克隆抗体，利用Western Blot和间接免疫荧光（IFA）鉴定单抗特异性，用获得的单抗对阴阳性肾脏切片进行免疫组化检测，用间接ELISA测定单抗效价和亚型，同时构建P2蛋白的不同截短体来鉴定得到的单抗识别的抗原表位。[结果]本研究获得三株能稳定分泌抗P2蛋白抗体的杂交瘤细胞，命名为1B10、3C6、5B1。单抗效价分别为1:2048000、1:512000、1:256000，亚型鉴定结果显示，三株单抗的重链均为IgG2b，轻链均为Kappa型。Western Blot和IFA结果显示，三株单抗均可以特异性结合鹅星状病毒，免疫组化结果显示，5B1和3C6可以应用于免疫组化的检测。表位结果显示，1B10识别₁₀₉TSTTSTGGLITELRN₁₂₃，3C6识别₂₀₆LTDPEEDDDPLS₂₁₇，5B1识别₉₆LNPELETAVLRV₁₀₇。[结论]本研究成功制备识别不同抗原表位的三株单克隆抗体，为快速检测GAstV感染和研究P2蛋白的结构与功能奠定基础。

为研究近来鳢科鱼类疫病频发的病因,实验对采集的患病杂交鳢病料分别从细菌学和病毒学两方面进行病原分离和鉴定。排除细菌感染的可能后,通过细胞培养技术、回归感染实验、电镜技术、分子生物学技术等进行病毒学分析,最终分离到一株弹状病毒,命名为HSHRV-C1207(Hybrid Snakehead Rhabdovirus-C1207)。实验结果显示,该病毒在EPC、FHM、GSB、SFC、CIK等8种细胞中都能复制,并对其中6种细胞产生明显的细胞病变效应(CPE)。用分离的病毒进行回归感染实验,可使感染的杂交鳢复制出自然发病鱼的相同症状,且死亡率达90%。感染病料组织液的EPC细胞固定后经电镜观察,发现...

【目的】由新型鹅星状病毒（novel goose astrovirus, nGAstV）引起的雏鹅痛风病对我国养鹅业造成了重大经济损失。通过构建nGAstV纳米抗体（nanobody, Nb）噬菌体展示文库，获得识别nGAstV ORF2蛋白的特异性Nb，可为建立nGAstV抗体检测方法及研究nGAstV ORF2蛋白结构和功能奠定基础。【方法】使用蔗糖密度梯度离心方法纯化在LMH细胞中增殖的nGAstV,RT-PCR鉴定nGAstV并通过细胞病变测定nGAstV滴度。用0.06%甲醛溶液灭活纯化的nGAstV作为免疫原，免疫两周岁羊驼。首次免疫时用灭活纯化的nGAstV与等量弗氏完全佐剂乳化后免疫，第2—5次免疫用灭活纯化的nGAstV与等量弗氏不完全佐剂乳化。每间隔两周免疫一次，每次免疫剂量均为50μg。第5次免疫14 d后，通过间接ELISA方法测定羊驼血清中针对nGAstV的IgG抗体效价。待IgG抗体效价达到构建噬菌体抗体展示文库标准时，分离羊驼外周血淋巴细胞（peripheral blood lymphocyte, PBL），然后提取PBL总RNA将其反转录为cDNA，利用巢氏PCR方法扩增重链抗体重链可变区（variable domain of the heavy chain of heavy chain antibodies, VHH）基因，将其构建至pComb噬菌体载体并结合噬菌体展示技术构建nGAstV Nb噬菌体展示文库，计算该文库库容量并分析其多样性。nGAstV作为靶抗原，通过三轮富集淘选初步获得与nGAstV反应的重组噬菌体Nb阳性克隆，将其克隆至pcDNA3.1-Fc真核表达载体并进行测序分析，将测序成功且序列不同的质粒转染至HEK-293F细胞中表达，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定表达情况。以nGAstV为靶标抗原，利用间接ELISA方法和Western blot试验对表达成功的Nb进行特异性、反应活性验证，并以nGAstV ORF2蛋白为靶标抗原，利用间接ELISA方法对Nb进行亲和力验证，获得生物学活性较好的Nb。【结果】RT-PCR结果显示，nGAstV增殖成功；Reed-Muench法分析nGAstV滴度达4.38 Log_(10)TCID_(50)/mL。羊驼经5次免疫nGAstV后，通过间接ELISA方法测得其血清中针对nGAstV的抗体效价达到1:64 000；利用巢氏PCR方法扩增出VHH并成功构建库容量为3.8×10~8 CFU/mL的nGAstV Nb噬菌体展示文库；遗传进化树分析显示，该噬菌体Nb库多样性良好。三轮富集淘选后，初步获得39株与nGAstV反应的重组噬菌体纳米抗体阳性克隆，其中有25株序列不同；SDS-PAGE鉴定结果显示，共有10株Nb在HEK-293F细胞中表达成功。通过ELISA、Western blot验证进一步获得8株与nGAstV ORF2蛋白特异性反应的Nb，且1株Nb生物学活性最好。【结论】首次筛选到与nGAstV ORF2蛋白特异性反应的Nb，为nGAstV的基础研究和检测方法提供材料。

从海南尖峰岭自然保护区巴西含羞草的根瘤中分离到一株根瘤菌,编号为caf324,经过16S rDNA全序列测定和系统发育分析,发现caf324与β-根瘤菌含羞草伯克霍尔德菌PAS44(AY752958)的亲缘关系很近,相似度达到99.7%。通过部分生理生化测定发现,caf324接触酶、氧化酶和硝酸盐还原试验均为阳性,不能利用明胶和淀粉,不能利用葡萄糖发酵产酸,不能水解酪素,不能产生吲哚和3-酮基乳糖;抗逆性研究表明,caf324的生长范围广,可耐2%的NaCl,耐酸碱(pH4～11),最高生长温度45℃。

【目的】分离鹅源坦布苏病毒,并研究其对雏鹅的致病性。【方法】用RT-PCR方法对江苏省3个鹅场送检的产蛋期病鹅样品进行检测;对坦布苏病毒核酸阳性的样品进行病毒分离,测定分离病毒的生物学特性和E蛋白基因序列。【结果】这些样品中坦布苏病毒呈阳性;从病料中分离鉴定一株病毒,命名为SHYG。E蛋白基因序列同源性比对显示其与中国鸭源坦布苏病毒同源性达到99.3%;生物学特性研究表明该病毒可致Vero细胞病变,对小鼠无致病性,接种2周龄雏鹅出现精神沉郁、腹泻、神经症状甚至死亡;组织学变化可见肝脏淤血、胆小管扩张、脂肪变性;肺淤血、炎性渗出及含铁血黄素沉着,脾脏网状内皮细胞空泡化,肾出血,脑充血、胶质细胞增...

【目的】目前使用的基因Ⅰ型猪瘟兔化弱毒C株疫苗是公认的安全、有效疫苗,但近年来基因Ⅱ群的猪瘟流行毒株比例增高,因此对猪瘟(CSF)的有效防控提出了更高要求。本研究旨在通过反向遗传学技术构建适应CSFV基因Ⅱ型的新型C株疫苗,为标记疫苗的开发奠定基础。【方法】在构建的C株感染性克隆基础上,拯救嵌合CSFV基因Ⅱ型HZ1-08毒株E2抗原区的重组C株病毒RecCHZE2,并分析其致病性和免疫原性。【结果】重组嵌合病毒RecCHZE2接种家兔后出现典型的定型热,兔脾脏肿大;重组嵌合病毒RecCHZE2接种猪只后没有发热和明显的白细胞减少,在接种后第12天检测到一过性的病毒血症;对接种猪血清检测结果表...

采用形态学和分子生物学方法对从玉米中分离纯化的优势霉菌进行鉴定,并在一定梯度的温度和湿度中进行培养,测量每日菌落和芽管生长速度,研究其生物学特性。结果表明:玉米中的优势霉菌为草酸青霉、串珠镰刀菌和黑曲霉。草酸青霉及串珠镰刀菌最适生长温度为30℃,黑曲霉为35℃;草酸青霉、串珠镰刀菌和黑曲霉分生孢子萌发的最适温度分别为30、25和35℃;草酸青霉及串珠镰刀菌最适生长湿度为70%,黑曲霉为80%;在自由水情况下,草酸青霉、串珠镰刀菌和黑曲霉分生孢子萌发率分别为72.5%、79.2%和85.1%。