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[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
叶潇铃 赵宇虹 姜楠 张敏 张迟
【目的】为了验证‘无子瓯柑’Citrus suavissima ‘Seedless’ E3泛素连接酶基因CsRNF217对雄蕊育性的影响，采用异源转化获得过表达CsRNF217的转基因烟草Nicotiana tabacum，分析其对烟草育性的影响。【方法】采用亚历山大染色法、花粉离体培养法、杂交授粉后的结实率分析野生型烟草及转基因烟草自交1代(T_1)阳性株系的花粉活力及胚囊育性，利用半定量RT-PCR分析基因CsRNF217在转基因烟草T_1阳性株系花药中的表达强弱。【结果】‘无子瓯柑’CsRNF217在转基因烟草自交T_1株系中高效表达，转基因株系的花粉染色活力和离体萌发率、自交结实率、以及与野生型的正反交结实率均显著低于野生型(P<0.05)。【结论】过表达CsRNF217的烟草植株花粉育性显著下降，同时伴随胚囊育性下降的现象，推测CsRNF217基因对‘无子瓯柑’雌雄育性存在负向调控的作用。图5表3参22
关键词：
柑橘 E3泛素连接酶 雄性不育 胚囊败育
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
刘琳硕 贺祥 李红梅 元青 王暄
[目的]本文旨在研究E3泛素连接酶基因的沉默对植物基础免疫及线虫寄生的影响,为揭示植物寄生线虫侵染寄主的分子机制提供理论依据。[方法]利用烟草脆裂病毒(TRV)介导的基因沉默技术(VIGS)沉默本氏烟E3泛素连接酶基因NbE3R14,用flg22处理基因沉默烟草叶片,RT-qPCR检测PTI(病原相关分子模式触发免疫,PAMPs-triggered immunity)相关基因的表达水平;接种辣椒疫霉于基因沉默烟草叶片,观察叶片病斑症状;采用室内人工接种法测定靶基因的沉默对南方根结线虫寄生的影响。[结果]RT-qPCR检测显示:农杆菌转化的烟草植株中NbE3R14基因已被成功沉默,flg22处理基因沉默烟草叶片激发的PTI相关基因GRAS2、WRKY7及WRKY8表达量分别下降41.3%、63.9%及61.8%,与野生型对照(WT)相比均有显著性差异(P<0.05),单卵块卵量则没有差异;而在TRV∷GFP处理植株上产生的根结数、雌虫数、卵块数以及单卵块卵量与WT均无明显差异。[结论]沉默NbE3R14基因能干扰植物基础免疫,从而导致烟草对辣椒疫霉及南方根结线虫的侵染更为感病。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
夏朝阳 安晓晖 张中起 葛冬冬 刘康
[目的]RING(really interesting new gene) finger E3泛素连接酶在植物生长发育和抵御环境胁迫中具有重要作用。克隆棉花RING finger E3泛素连接酶基因GhRING1-like并分析其表达特征和功能,为该基因分子作用机制研究和育种应用奠定基础。[方法]根据棉花表达谱分析,选取并克隆干旱胁迫处理上调表达基因GhRING1-like,qRT-PCR分析GhRING1-like的组织表达特性及其对不同非生物胁迫和激素处理的响应模式;采用瞬时表达对GhRING1-like-GFP融合蛋白进行亚细胞定位分析;通过获得病毒介导的基因沉默(VIGS)棉花和过表达拟南芥植株,分析沉默或过表达GhRING1-like对植株生长发育及其抗旱性的影响。[结果]GhRING1-like基因序列全长996 bp,编码332个氨基酸,其C端含有RING-H_2(C3H_2C3)结构域。GhRING1-like定位于内质网上。GhRING1-like在叶片中优势表达; 200 g·L~(-1)PEG6000诱导处理1 h后瞬时显著上调表达12倍; GhRING1-like对Na Cl、ABA和SA的响应时间都在处理后3 h,上调表达均在5倍左右。干旱胁迫处理后,VIGS沉默GhRING1-like棉花叶片相对含水量和叶绿素荧光参数Fv/Fm分别较未沉默对照降低17.1%和30.6%,而电解质渗透率和丙二醛含量分别较对照提高70.8%和100%。过表达GhRING1-like显著提高了拟南芥种子萌发和幼苗期对于甘露醇引起的渗透胁迫的耐受性;可使营养生长中后期阶段的拟南芥在水分亏缺处理下的存活率提高2.4倍;转基因拟南芥叶片气孔开度降低51.2%,失水率明显降低。干旱胁迫下,过表达GhRING1-like使依赖于ABA诱导表达的At AREB1、At ERD15、AtRD29A上调表达,而对不依赖ABA的干旱胁迫诱导基因At DREB和脯氨酸合成基因At PLD没有影响。[结论]棉花GhRING1-like参与了植物非生物胁迫抗性的调控,主要通过依赖于ABA通路正向调控植物的抗旱反应。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
金姝雯 安晓晖 葛冬冬 刘康
[目的]本文旨在克隆陆地棉U-box E3泛素连接酶基因GhPUB19D并分析其在抵御生物和非生物胁迫中的功能及其作用机制。[方法]利用PCR从棉花cDNA文库中扩增盐胁迫和大丽轮枝菌处理均上调表达的GhPUB19D全长cDNA;qRT-PCR分析GhPUB19D的组织表达特征及其对不同非生物胁迫处理的响应;构建pBIN-GhPUB19D-GFP载体并导入烟草叶片中,分析GhPUB19D的亚细胞定位;利用病毒介导的基因沉默(VIGS)和转基因过表达GhPUB19D基因分析该基因对植物的耐盐性和抗病性的影响。[结果]GhPUB19D基因ORF全长2 043 bp,编码680个氨基酸,其编码的蛋白质含有1个U-Box和3个ARM结构域,定位于高尔基体。GhPUB19D基因启动子区存在多种逆境胁迫响应顺式作用元件。GhPUB19D在棉花根和叶片中优势表达。聚乙二醇(PEG)、NaCl、脱落酸(ABA)、乙烯(ET)、水杨酸(SA)、赤霉素(GA3)处理后,均可诱导GhPUB19D在1 h达到表达峰值。VIGS沉默GhPUB19D棉花在接种大丽轮枝菌Vd991之后,叶片黄化和枯萎较正常植物更为严重,植株发病率和病情指数均极显著增加。转GhPUB19D基因可以提高拟南芥在ABA处理下的种子萌发率,但不能减轻ABA对幼苗生长的抑制作用;转GhPUB19D基因可以提高拟南芥幼苗的耐盐性,ABA的SnRK2.3/2.6信号通路下游的AtABF3和AtABF4对盐胁迫的响应增强,而AtRD26、AtMYB44、AtRAB18、SLAH3等对盐胁迫的响应减弱。转GhPUB19D基因可以显著减轻大丽轮枝菌病症,显著降低拟南芥植株中大丽轮枝菌含量,提高AtPR1、AtPR2、AtPR3、AtPR4、AtPR5、AtNPR1等系统获得抗性相关基因的表达及其对大丽轮枝菌的响应。[结论]过量表达GhPUB19D可显著提高植物的耐盐性和黄萎病抗性。
[期刊] 华北农学报
[作者]
李姗姗 黄梦婷 青雨虹 许静 黄君梅 凌辉 阙友雄 黄宁
为探究甘蔗PROTEOLYSIS 1(PRT1)基因与黑穗病菌的互作关系，以甘蔗割手密种和栽培品种为研究对象，通过RT-PCR技术对ScPRT1(GenBank登录号：MT747433)基因进行克隆，生物信息学分析、定量PCR、亚细胞定位和基因共表达网络分析。生物信息学分析表明，该基因的cDNA全长为1 621 bp,包含一个长度为1 260 bp,编码419个氨基酸的完整开放读码框；其编码蛋白的分子量为46.56 ku,为酸性、不稳定的亲水蛋白，无信号肽，具有核定位信号；该蛋白包含2个RING结构域和1个ZZ结构域；ScPRT1蛋白的高级结构元件多为无规则卷曲。定量PCR结果显示，ScPRT1在皮、叶片、芽中的表达量相差不大，在蔗髓中表达量最高。同时该基因的表达受脱落酸胁迫后显著上调；受黑穗病菌胁迫后，在甘蔗抗黑穗病品种中上调表达，在感黑穗病品种中下调表达，都达到了显著水平。亚细胞定位结果揭示，ScPRT1定位于细胞核。寄主甘蔗和病原黑穗病菌的基因共表达网络中，与甘蔗ScPRT1共表达的黑穗病菌基因中，有3个为N端具有芳香族氨基酸残基的黑穗病菌效应蛋白，这暗示它们之间存在直接的相互作用。以上结果表明，ScPRT1在甘蔗激素信号传导以及响应黑穗病菌侵染过程中发挥重要作用。
[期刊] 水产学报
[作者]
张东玲 喻达辉 陈健 叶坤 王志勇
为探究大黄鱼ＭＡＲＣＨ５Ａ的免疫作用，实验采用反转录ＰＣＲ确认了该基因的Ｃ ＤＮＡ序列。该序列全长１０４５ ｂＰ，包含１个长度为８６７ ｂＰ的开放阅读框，编码２８８个氨基酸；序列分析显示该蛋白含１个ＲＩＮＧｖ和４个跨膜结构域。进化树分析表明大黄鱼有１１个ＭＡＲＣＨ家族蛋白（与哺乳动物相同），但鱼类存在多个亚型，ＭＡＲＣＨ５Ａ为鱼类特有蛋白，其蛋白理化性质和三维结构均与ＭＡＲＣＨ５ｂ存在一定的差异。荧光定量ＰＣＲ分析显示，ＭＡＲＣＨ５Ａ在健康大黄鱼的多个组织中均有表达，在血液和心脏中表达量最高，其次为鳃和脑，而在肾脏和皮肤中表达量最少。刺激隐核虫感染大黄鱼后，ＭＡＲＣＨ５Ａ在皮肤中早期表达量显著．．．
[期刊] 西南农业学报
[作者]
吴纯清 张兴国 梁国鲁 苏承刚
为了分析CBF3和COR15a双价基因的抗寒价值,通过模式植物烟草抗寒性的改良,为其他经济作物的抗寒改良提供理论和实践依据。将低温诱导启动子AtRD29a分别控制的拟南芥CBF3低温应答转录激活因子基因和COR15a冷诱导基因一起转入烟草,通过低温处理实验、生理生化指标测定分析转基因烟草的抗寒性。结果表明:外源基因已经整合到烟草基因组中,转基因植株在1℃48 h未出现萎蔫,而非转基因植株1℃12 h即出现萎蔫状态;转基因植株LT50为-1.01℃左右,非转基因植株LT50为0.86℃,转基因植株的细胞膜伤害率比非转基因植株低20%,半致死温度低约1.87℃;转基因植株的POD活性、可溶性糖含量...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
孟凡宏 宋从凤 纪兆林 王金生
将水稻黄单胞细菌白叶枯致病变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)编码HarpinXoo的hrfA基因及其N-末端缺失突变基因AB分别连接到双元载体pBI121上,构建成转基因载体,并经冻融法转化土壤杆菌EHA105。采用叶盘法转化烟草,用卡那霉素抗性筛选再生植株。通过PCR扩增检测了转化烟草中的靶基因序列及35S启动子序列,对T1代PCR阳性植株进行了PCR-Southern杂交和RT-PCR分析。结果显示,外源基因已经整合到转基因烟草基因组中,并在转录水平正常表达。用从转hrfA基因和AB片段的烟草中提取的可溶性蛋白注射烟草都能引起过敏反应,说明目的基因在转基因烟草中...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
陈曙 张彧 陈卓 金辉
【目的】U-box基因家族广泛存在于植物基因组中，能够编码泛素蛋白酶体系中特异性识别底物的泛素E3连接酶，调控蛋白的修饰和降解，对玉米的生长发育及逆境胁迫应答调控中起着重要作用，因此鉴定玉米U-box基因家族成员及进行基因功能研究具有重要意义。【方法】通过玉米全基因组数据库，利用一系列生物信息学工具对玉米U-box基因家族成员进行鉴定和功能分析。【结果】玉米U-box基因家族共鉴定筛选出76个成员，在玉米全基因组1～10号染色体上均有分布，氨基酸数目大小为94～1353 aa，蛋白等电点数值差距较大，从4.86到8.29不等。基因结构分析结果显示各成员间含有内含子数目不等，其中玉米U-box家族76个成员中共有28个基因无内含子，仅含有1个外显子，占玉米U-box基因总数的36.8%，表明这些基因进化可能源于转座子机制。系统进化分析结果显示水稻、拟南芥、玉米U-box基因分布在亚家族Ⅰ～Ⅸ中，其中亚家族Ⅳ中不含水稻、拟南芥U-box成员，仅含有2个玉米基因ZmPUB41和ZmPUB53，暗示了玉米在历史进化过程中在发生了多次家族基因扩增的同时也经过片段快速变异过程。启动子功能预测分析发现玉米U-box基因在玉米光合作用、植物激素应答以及逆境胁迫等方面发挥相应作用。基因组织表达分析显示玉米U-box基因表达特异性明显，主要在种子的组成型器官中表达，暗示了目标基因可能参与了种子的形成或萌发过程。部分基因如ZmPUB12、ZmPUB18、ZmPUB30、ZmPUB40、ZmPUB75仅在花粉中检测出有表达量，说明其可能参与了玉米花粉粒的形成或受精过程。【结论】玉米U-box基因在玉米的光合作用、生长发育以及逆境胁迫应答等生理活动中发挥了重要作用，为后续对玉米U-box基因功能、蛋白代谢和信号转导等重要调控网络研究提供了理论基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
徐妙云 周建 张兰 范云六 王磊
【目的】克隆大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶基因(GmVTE3),研究其在烟草中过量表达对转基因烟草种子中生育酚(维生素E)组分的影响。【方法】利用EST拼接和RT-PCR技术,从大豆中分离了大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶(VTE3)的全长cDNA序列,通过烟草转化研究过量表达VTE3对转基因植株维生素E组分的影响。【结果】GmVTE3全长1026bp,编码342个氨基酸,与其它物种的VTE3氨基酸同源性很高,在烟草中过量表达该基因使烟草种子中γ-生育酚与δ-生育酚的比值最高增加2倍。【结论】首次克隆了大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶基因GmVTE3...
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
沈辰 裘佳妮 黄坚钦
COP1 E3连接酶是一个光形态建成的抑制子和光调控植物发育的分子开关。对山核桃Carya cathayensis花芽454测序获得Cc COP1 E3连接酶的片段,通过c DNA末端快速扩增技术(RACE),分别获得该基因的全长,大小为2 331 bp,它由2个特殊的结构域组成即环形锌指结合域和WD-40重复序列,其编码的蛋白质有较强的亲水性,在氨基端主要是亲水性氨基酸,而羧基端主要是疏水性氨基酸。Cc COP1 E3连接酶与毛果杨Populus trichocarpa等的COP1 E3连接酶同源基因相似度较高,总体高达77.80%。实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time PCR)结...
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
俞狄虎 张迟 柯甫志 敬露阳 顾雪娇 吴宝玉 张敏
为研究查尔酮合成酶基因(CHS)家族在‘无子瓯柑’ Citrus suavissima ‘Seedless’雄性不育发生过程中的作用,以克里曼丁橘Citrus clementina基因组数据库为参照,在‘无子瓯柑’和瓯柑Citrus suavissima的转录组和蛋白质组测序结果中筛选出4个CHS同源差异表达基因,并对其克隆和表达量分析,对克里曼丁橘CHS基因家族成员进行生物信息学分析。结果表明:‘无子瓯柑’和瓯柑CHS基因编码区核苷酸序列相似度达98%以上。小孢子母细胞发育各时期CHS基因表达量在瓯柑和‘无子瓯柑’间差异显著。与瓯柑相比,‘无子瓯柑’小孢子母细胞时期Ciclev10005133m, Ciclev10030093m和Ciclev10015535m的表达量显著下调;减数分裂时期Ciclev10005133m,Ciclev10001405m和Ciclev10015535m的表达量显著下调;四分体时期Ciclev10001405m和Ciclev10030093m的表达量显著减少。在花粉粒成熟时期的花蕾中,Ciclev10001405m与Ciclev10005133m在花药中特异性表达。CHS同源基因在花药不同时期中的差异表达可能是‘无子瓯柑’花药发育异常的重要原因,并最终导致‘无子瓯柑’雄性不育。图3表6参15
[期刊] 中国农业科学
[作者]
朱常香 宋云枝 温孚江
【目的】利用RNA介导抗性培育抗多种植物病毒的转基因烟草。【方法】分别以马铃薯Y病毒(PVY)、烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)全长衣壳蛋白(CP)基因为模板,通过设计PCR引物和亚克隆获得PVYCP3′端长度100bp、TMVCP3′端长度100bp和CMVCP3′端长度200bp的cDNA片段并拼接成嵌合基因,并以此为模板构建反向重复结构嵌合基因的植物表达载体pRHPTC。将pRHPTC通过冻融法导入农杆菌LBA4404,采用叶盘法转化烟草NC89,然后测定转基因烟草对3种病毒的抗性。【结果】经卡那霉素筛选和PCR检测,共获得276株转基因烟草。Southern和Northe...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
周文丽 唐永红 陈耀锋 成巨龙 王会强 杨梅
【目的】利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,GV3101)介导法获得转芪合酶基因烟草,改良烟草对根黑腐病的抗性。【方法】以普通烟草品种"97204"叶片为受体,采用根癌农杆菌介导法,将芪合酶基因导入烟草基因组并进行分子检测,利用灌根法对4株转芪合酶基因烟草植株接种烟草根黑腐病菌,观察烟草地上部分和根部的变化,并测定苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)活性。【结果】通过根癌农杆菌介导、抗性选择和分子检测,获得32株转芪合酶基因烟草。从中选取长势一致的4株转基因烟草用于抗病性鉴定,结果表明,2株在灌根接种后生长正常,另外2株在接种第7天时出现轻微黄化,3株...
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