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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
李夏 戴佳乐 陈子奇 付永平 马建 曲静 王丕武
【目的】构建β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因具有功能性间隔序列的发夹结构(Intron-hairpin RNAi,ihp-RNA)的RNA干扰(ihp-RNAi)表达载体并转化大豆,为通过RNA干扰技术改良大豆的营养品质奠定基础。【方法】以大豆总RNA反转录获得的cDNA为模板,通过PCR扩增克隆了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因的核心保守序列(400bp),并将该片段的反义和正义片段插入到重组植物表达载体p3301-P的种子特异性启动子7αp下游,将功能性间隔序列intron-SSR插入反义片段与正义片段之间,构建α′-亚基基因ihp-RNAi安全型表达载体p3301-PFNZ-α′-BADH,...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
孙智峰 王蕾 刘羽佳 丁红研 王志 李思婷 王承智 李玉 王希春 吴金节
[目的]研究β-伴大豆球蛋白通过核因子-κB(N F-κB)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、c-Jun N端激酶(JNK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号通路对猪肠上皮细胞(IPEC-J2)造成损伤的差异,为探索β-伴大豆球蛋白引发仔猪肠道黏膜损伤的分子机制提供理论依据。[方法]采用β-伴大豆球蛋白体外诱导IPEC-J2损伤,试验设对照组T0(猪肠上皮细胞不做处理),试验组T1 (加入5 mg/mLβ-伴大豆球蛋白)、T2(加入5 mg/mLβ-伴大豆球蛋白+1μmol/L NF-κB抑制剂二硫氨基甲酸肽吡咯烷(PDTC))、T3(加入5 mg/mLβ-伴大豆球蛋白+1μmol/L iNOS抑制剂Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME))、T4(加入5 mg/mLβ-伴大豆球蛋白+1μmol/L JNK抑制剂SP600125)和T5(加入5 mg/mLβ-伴大豆球蛋白+1μmol/L p38抑制剂SB202190),处理24 h后观察细胞结构,测定各组细胞活性及细胞因子NO、TNF-α、IL-10、IFN-γ含量,细胞损伤相关基因NF-κB p65、iNOS、JNK、p38及其编码蛋白的表达水平。[结果]在IPEC-J2中加入5 mg/mLβ-伴大豆球蛋白24 h后,细胞数量减少,线粒体改变,染色质边集,细胞活性显著下降(P<0.05),NO、TNF-α、IFN-γ含量均极显著增加(P<0.01),而IL-10含量极显著减少(P<0.01),NF-κB、iNOS、JNK、p38蛋白表达量极显著上升(P<0.01);加入抑制剂后,细胞活性显著提高(P<0.05),细胞结构趋于完整和规则,IL-10含量极显著增加(P<0.01),而NO、TNF-α、IFN-γ含量极显著减少(P
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王丹 付永平 王丕武 马建
【目的】应用RNA干扰技术同时抑制大豆脂肪氧化酶(Lox)和胰蛋白酶抑制剂(KTi)基因的表达,改良大豆品质,培育缺失Lox和KTi的大豆新材料。【方法】应用RNAi原理,以双价RNAi植物表达载体pCAM-BIA1301-KtiRi-LoxRi为基础,以植物表达载体pCAMBIA3301的质粒DNA为模板,利用CaMV35S启动子的上游引物和CaMV35S终止子的下游引物,PCR扩增含有除草剂抗性基因bar的整个表达原件,然后将其插入到pCAM-BIA1301-KtiRi-LoxRi中,构建以除草剂为筛选标记的双价RNAi表达载体,并通过花粉管通道法转化至大豆吉农18、吉农28和吉农27 3...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘珊珊 孟凡立 刁桂珠 王志坤 葛玉君 郑天慧 姜自芹 曾蕊 李文滨
【目的】明确大豆7S球蛋白(α+β)-亚基双缺失特性是否是由于α-与β-亚基基因的缺失或变异引起的。【方法】聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析和α-与β-亚基基因的PCR扩增、克隆、测序和序列比较。【结果】该种质α-亚基基因特异性引物的PCR扩增结果与对照基本一致,β-亚基基因的则与对照不同。α-亚基基因扩增片段与对照的同源性较高,为90.9%,二者的区别主要存在于扩增片段的5′-端;β-亚基基因间的同源性较低,仅为53.1%。另外,在该材料β-亚基基因扩增片段的两端,检测到一对短的反向重复序列。【结论】该种质α-与β-亚基同时缺失的特性不是由α-与β-亚基基因的缺失引起的;α-与β-...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
周勇 曾令兵 范玉顶 罗晓松 徐进 肖艺
根据GenBank中草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)VP6蛋白的全基因序列(AF403394)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的基因序列(M17874),设计并合成特异性引物,从感染草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾细胞(CIK)中提取病毒核酸作为模板,进行RT-PCR扩增,得到约1.3 kb的GCRV VP6基因读码框片段,同时提取大肠杆菌(Escherichia coli)H44815全基因组作为模板,进行PCR扩增得到约370 bp的LTB基因读码框片段。将获得的2个目的片段分别克隆到pCR2....
[期刊] 中国农业科学
[作者]
左伟勇 陈伟华 邹思湘 张源淑
【目的】在分子水平上探讨伴大豆球蛋白水解肽对肠道双歧杆菌生长的影响。【方法】选取21日龄健康清洁级雄性SD大鼠,随机分为4个处理,每个处理3只,基础日粮预饲1周后,分别灌胃生理盐水(对照组)、伴大豆球蛋白液(Conglycinin组)、伴大豆球蛋白酶水解肽P2组分(P2-PTC组)、伴大豆球蛋白盐酸彻底水解液(HCl-FHC组),各0.5ml,1次/天。除对照组外,各处理组灌胃液体总含氮量相等(折合蛋白含量为0.5mg·ml-1),试验共21d。应用PCR-DGGE技术分析灌胃伴大豆球蛋白酶解肽对大鼠粪样细菌区系变化的影响,并采用连续稀释PCR的方法半定量研究伴大豆球蛋白酶解肽对大鼠肠道双歧杆...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
左伟勇 陈伟华 邹思湘
90只清洁级昆明系小鼠,随机分为5组,预饲基础日粮一周后,各组分别灌胃:生理盐水(对照组,CK)、伴大豆球蛋白液(Ⅰ)、伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解液(Ⅱ)、伴大豆球蛋白胃蛋白酶水解液提纯B组分(Ⅲ)、伴大豆球蛋白盐酸水解液(Ⅳ),除对照组外,各处理组灌胃液体总含氮量相等,实验期21d。结果显示:与对照组相比,第3周Ⅱ组和Ⅲ组每只小鼠日均采食量较对照组显著下降,分别降低8.75%(P<0.05)和9.28%(P<0.05);Ⅲ组小鼠胸腺相对质量极显著下降,降低了10.40%(P<0.01),肠黏膜sIgA水平提高45.49%(P<0.01),大肠食糜中6磷酸果糖酮糖酶(F6PPK)活性极显著提高(...
[期刊] 华北农学报
[作者]
许宗宏 郝青南 陈李淼 孙佃臣 田星星 单志慧
大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)是马铃薯Y病毒组(Potyvirus)成员之一,大豆花叶病毒病可造成大豆10%~30%的产量损失,并严重影响大豆的品质。不同株系间致病力差异源于它们在碱基序列上的差异。采用传统的抗病育种技术育成的抗病品种抗谱窄,品种抗性可因病毒株系的变异而丢失。依靠RNA引发的基因沉默改善植物的抗病毒能力是基于RNA i(RNA inference)原理建立的植物抗病毒新策略,本研究对来源于武汉SMV分离物的CP基因和Nib基因进行了克隆,通过对保守区域的扩增,采用Gateway技术构建了大豆抗花叶病毒的RNA干扰载体。为防治大豆花叶病毒新技术的...
[期刊] 华北农学报
[作者]
斯钦巴特尔 张辉 贾霄云 高风云 张立华 任龙梅
亚麻雄性不育相关基因MS2-F在亚麻花粉发育过程中起重要的作用。为了研究其功能,构建了2个RNAi载体。选定该基因的2个不同的片段,分别以正向和反向插入到pHANNIBAL载体中PDK intron的两侧,以形成hpR-NA表达盒。然后将hpRNA表达盒插入到pART27的NotⅠ酶切位点上,成功构建了2个亚麻MS2-F基因的RNAi载体。最后将载体导入到农杆菌LBA4404中。RNAi载体成功构建,为验证MS2-F基因在亚麻花粉发育过程中的生物学功能奠定基础。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
杨礼香 王正询 柯德森 巫锦雄
为研究拟南芥血红蛋白1基因(AtGLB1)的功能,将AtGLB1基因构建入超表达载体pMD和RNAi载体pZYI中,并采用花序浸染法将重组质粒转化拟南芥Columbia得到了转基因植株。对超表达株系和RNAi株系的纯合体进行Northern分析,结果表明:超量表达的拟南芥株系中AtGLB1的表达水平比野生型高很多,而表达被抑制的RNAi株系中几乎检测不到AtGLB1基因的表达。这些AtGLB1表达水平不同的拟南芥株系的获得可为该基因功能的后续研究以及在农业生产中的应用奠定一定基础。
关键词：
拟南芥血红蛋白1 超表达 RNAi
[期刊] 华北农学报
[作者]
贺建华 李文利 魏立君 夏秀英
人β淀粉样蛋白(Amyloidβ peptide,Aβ)是治疗阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s disease,AD)的关键靶标之一。本试验利用重叠PCR技术获得2Aβ串联基因片段,并将其克隆到植物表达载体pBIDST(含双35S启动子和TEV增强子)中。用根癌农杆菌EHA105介导转化烟草,筛选获得了卡那霉素抗性植株。PCR和RT-PCR检测结果证实2Aβ基因已经整合进烟草基因组中并进行了转录。
关键词：
β淀粉样蛋白 植物表达载体 转基因烟草
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
王海峰 许文涛 苏春元 黄昆仑 罗云波 谷新晰 邱芳萍
从人体肾脏组织中提取的总RNA中通过反转录PCR(RT-PCR)扩增得到了ELA2B基因,并将其克隆到pGEM-T easy载体中。然后用限制性内切酶BamH I和HindⅢ对重组质粒pGEM-T easy/ELA2B和大肠杆菌E.coli表达质粒pET30a进行双酶切,成功构建了原核表达载体pET30a/ELA2B。将重组质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21中,通过PCR和表型鉴定表明,ELA2B基因已经整合到大肠杆菌BL21染色体上。用IPTG对重组的大肠杆菌BL21进行诱导表达,得到的蛋白经SDS-PAGE分析结果表明:菌体中含有一明显特异性蛋白,大小为28 kD。经包涵体复性后在弹性蛋白酶...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
付永平 张君 王丕武 周海涛 曲静
【目的】构建具有大豆蛋白酶抑制剂BBi基因反向重复结构的ihpRNA种子特异性表达载体,并将其转入根癌农杆菌中,为大豆品质改良奠定基础。【方法】采用PCR技术克隆大豆蛋白酶抑制剂BBi基因的正义和反义片段、大豆种子特异性启动子7αP和作为内含子的GFP基因片段,分别连入克隆载体pMD18-T Vector中。然后根据植物中ihpRNA原理,以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,将组成RNAi载体的4个目的片段分别连入其中,然后利用冻融法转化根癌农杆菌,并进行PCR鉴定。【结果】PCR扩增得到组成RNAi载体的4个目的片段,分别构建成重组克隆载体和ihpRNA种子特异性表达载体p7αP-G...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
曲宪成 周正峰 崔严慧 刘颖 胡萍华 金一春 尚婧瑨
首先运用PCR-末端加尾法克隆了团头鲂(Megalobrama amblycephala)脑下垂体糖蛋白激素α亚基(Pituitary glycoprotein hormone α subunit,PGPH α)基因5’端侧翼序列;然后利用生物信息学理论对该序列进行了序列分析;最后在序列分析结果的基础上,构建了荧光素酶质粒表达载体。序列分析结果显示,克隆所得到的团头鲂PGPH α亚基基因5’端侧翼序列长1399bp;其序列中包含潜在的TATA盒、GC盒,以及ERE、TRE、CRE、PGBE等对PGPH α亚基基因转录调控起重要作用的转录因子结合位点;启动子区域位于-40~10bp处。利用PCR...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
胡林勇 陈华涛 李倩 徐晓彬 王爱华 靳亚平
【目的】构建山羊β-乳球蛋白(BLG)基因打靶载体,以期用人乳白蛋白(hALA)基因的编码区置换山羊BLG基因的编码区,借助BLG的内源性调控序列指导hALA的表达。【方法】以山羊血液基因组为模板PCR扩增获得BLG基因的5′端侧翼序列(BLG5)、第5外显子和第5内含子的部分序列(E5)和3′端侧翼序列(BLG3),同时以人血液基因组为模板克隆了hALA基因的基因组序列(ALA),并将上述片段连接到克隆载体pMD18 T-simple或pBluescript KS(-),得到载体pB5T,pB3T,pAKS和pAEKS。对pB5T进行亚克隆,将BLG5连接到pAEKS中,构建载体pBAE;最...
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