【摘要】【目的】Nanog基因是一种参与调控与维持干细胞多能性的转录因子，Nanog异位表达可以使体细胞重编程并获得一定的多能性。克隆荣昌猪Nanog基因，构建pMX逆转录病毒载体并鉴定表达载体的转染效率，为荣昌猪进一步的遗传改良与干细胞研究打下基础。【方法】以荣昌猪生殖嵴为材料，提取总RNA并反转录为cDNA，经PCR扩增克隆得到荣昌猪Nanog基因。采集荣昌猪耳部组织用组织块法培养荣昌猪成纤维细胞，选择第3～5代的猪成纤维细胞作为转染细胞，通过T-A克隆构建pMD18T-Nanog载体；采用T4连接法将Nanog基因连接到pMX逆转录病毒载体上，酶切鉴定后构建pMX-Nanog-neo表达载体，然后将报告基因EGFP连接到pMX-Nanog-neo构建pMX-Nanog-EGFP表达载体。采用脂质体LTX法进行转染，将pMX-Nanog与pCMV-VSVG按照2∶1的比例混合后，将pMX-Nanog-EGFP表达载体转染293GP包装细胞并收集病毒上清液备用，利用Hoechst染核与Nanog抗体免疫组化鉴定其转染表达效果，随后采用相同方法将pMX-Nanog-neo表达载体转染荣昌猪成纤维细胞并扩大培养，同时通过G418筛选阳性细胞株。【结果】成功克隆出荣昌猪Nanog基因，并成功构建pMX-Nanog-neo与pMX-Nanog-EGFP逆转录表达载体。pMX-Nanog-EGFP表达载体转染293GP细胞，48 h后可见稳定表达的EGFP荧光，细胞扩大培养后通过Hoechst染核与Nanog抗体免疫组化鉴定确认了Nanog基因为稳定核表达蛋白，从而确定所构建的逆转录表达载体可以高效转染细胞并稳定表达目的基因。pMX-Nanog-neo载体转染猪成纤维细胞，通过G418（600 ng/mL）筛选获得稳定表达Nanog基因的阳性细胞株。【结论】构建的pMX逆转录病毒表达载体可以将目的基因Nanog稳定转染猪成纤维细胞并高效表达，为今后进一步研究荣昌猪干细胞多能性维持机制、自我更新机制、分化机制及重编程机制提供可靠的技术方法。