【摘要】【目的】籼粳亚种间杂交F_1的育性问题严重阻碍了亚种间杂种优势的利用，探究籼粳杂种不育的遗传机理，挖掘新的籼粳杂种不育调控基因，为促进籼粳杂种结实率遗传改良提供理论依据。【方法】粳稻品种Sasanishiki和籼稻品种Habataki杂交后，采用单粒传法自交10代，获得包含95个株系的稳定遗传重组自交系（RIL），基于Illumina平台，对双亲和RIL进行高通量测序，在全基因组水平分析RIL中Habataki血缘的分布与比例，进而鉴定偏分离区域作为潜在的籼粳杂种不育位点。同时，剖析“全球3000份水稻核心种质资源重测序计划”中典型籼粳稻基因组变异数据，对群体水平进一步验证并趋近目标育性基因区域。最终通过序列比对锁定籼粳杂种不育候选基因。应用CRISPR基因编辑技术进行定点基因敲除，对目标基因进行功能验证。【结果】Habataki和Sasanishiki的杂交F_1在穗数、每穗粒数和千粒重上体现出明显的杂种优势，但其结实率显著降低，I_2-KI镜检发现F_1花粉育性显著降低。RIL的全基因组高通量测序在第1、3、5、6、7和12染色体上检测到明显的偏分离，即该区域的基因型趋向于籼稻Habataki。通过序列比对，进一步确定已知育性基因Sc、S5和HSA1为第3、6和12染色体上偏分离区域的目标基因。应用CRISPR基因编辑技术敲除Habataki中Sc-Haba-3的多拷贝，成功改善了其与Sasanishiki杂交F_1的花粉育性和结实率，说明该基因可独立行使功能。同时，在第1染色体的偏分离区域发现Habataki和Sasanishiki之间存在复杂的结构性变异，Sasanishiki基因组中一段24.7 kb包含4个预测基因的片段在Habataki中被一段64.8 kb包含10个预测基因的片段取代，此结构性变异可能参与籼粳杂种育性的调控。【结论】检测到多个籼粳杂种不育相关位点，应用CRISPR基因编辑技术敲除Habataki中Sc的多拷贝成功改善其杂种F_1育性，确定其为水稻亚种间育性改良的目标基因。同时锁定了第1染色体Sd区域的目标基因。