【摘要】【目的】硬实是种子物理休眠的表现特征，也是大豆驯化的一个重要性状。硬实性虽然有利于种子在不良环境中生存，但是在生产实践中会严重降低大豆出苗率，同时影响产量和加工品质。采用混合群体分离测序（bulked segregant analysis sequencing,BSA-Seq）解析大豆种子硬实性状的遗传基础及候选基因，为大豆硬实的分子机理研究提供理论依据。【方法】经甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate,EMS）诱变大豆中品661种子获得硬实突变体M_(zp661)，将其与栽培大豆中黄13（父本）杂交构建重组自交系（recombinant inbred line,RIL）群体，对不同株系的种子进行硬实性、吸水率和种皮解剖结构鉴定。选取RIL群体中硬实型和正常吸胀型2种极端材料分别构建混池，利用BSA-Seq技术检测不同极端材料及亲本基因型，结合欧式距离（euclidean distance,ED）和delta SNP-index、delta InDel-index关联分析方法，开展大豆种子硬实遗传位点的挖掘，进一步利用生物信息学分析、大豆不同组织的转录组数据和基因注释信息挖掘显著关联区域的候选基因。【结果】突变体M_(zp661)后代中，吸胀型种子各部位均具有吸水能力，种子体积随浸水时间延长不断增大，然而，硬实型种子浸水36 h内体积未发生变化，随着浸水时间的持续延长，种皮开始局部出现皱缩，并逐渐向其他部位扩散，子叶恢复吸胀能力。硬实型种子种皮表面光滑且结构紧密、角质层呈规则的网状结构、栅栏层较厚，而吸胀型种子表皮有气孔且结构松散、角质层有微小的裂缝、栅栏层较薄，表明突变体M_(zp661)种子硬实与种皮不透水/气相关；ED和delta SNP-index、delta InDel-index关联分析方法不仅鉴定到已报道种子物理休眠遗传位点qHS1，而且检测到1个一致性关联区域Chr.06:45897227—47746047，该区间共含有189个基因，转录组数据及基因注释挖掘到种子中特异高表达的Glyma.06G275300可能为该关联区域调控大豆种子硬实的关键候选基因。【结论】大豆突变体M_(zp661)种子硬实由种皮不透水/气所致，利用BSA-Seq法鉴定到Glyma.06G275300可能为影响种皮结构的候选基因。