FTA卡保存对虾传染性皮下和造血组织坏死病毒DNA洗脱方法的优化
2023-11-20分类号:S945.4
【部门】浙江海洋大学水产学院 中国水产科学研究院黄海水产研究所海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室农业农村部海水养殖病害防治重点实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室
【摘要】传染性皮下和造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus, IHHNV)是危害虾类健康养殖的重要病原,为寻找一种快捷保存及分离IHHNV DNA的方法,为后续研究提供完整的核酸材料,选用FTA (flinders technology associates)卡为保存介质,以FTA纯化试剂、TE (Tris-EDTA)缓冲液及去离子水为基础洗脱液,设计了7种FTA卡黏附DNA洗脱方法,通过荧光定量PCR检测方法检验不同核酸洗脱分离效果及最低的点膜核酸量。结果显示,于4 mm~(2)的FTA卡上,点样体积为2.5 μL,用洗脱液作为模板时,最低点膜核酸浓度需要1.47×10~(4) copies/μL以上,可获得最佳的检测灵敏度和100%检出率的洗膜方法为50 μL TE缓冲液于95 ℃下浸洗5 min;用膜片做模板,点膜核酸浓度需要1.82×10~(3) copies/μL以上,室温(20~25 ℃)下用FTA纯化试剂洗脱3次,再用TE缓冲液洗脱2次,洗脱时间均为5 min,可获得最佳的检测灵敏度和100%的准确度。以FTA卡保存对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)、虾十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1, DIV1)、偷死野田村病毒(covert mortality noda virus, CMNV)、致急性肝胰腺坏死副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, V_(pAHPND))核酸,测试所建洗脱方法的效果,证实了该方法对其他虾类病原核酸的洗脱具有通用性。该研究给出了FTA卡保存和洗脱IHHNV DNA的适用性方案,为野外对虾样品采集、病毒核酸样品跨区域传递的保存和运输条件提供了科学数据。
【关键词】IHHNV FTA卡 洗脱方法 优化
【基金】中国水产科学研究院基本科研业务费(2022GH01);; 中国水产科学研究院黄海水产研究所基本科研业务费(20603022021012);; 国家重点研发计划(2019YFD0900101)和国家现代农业产业技术体系(CARS48)共同资助
【所属期刊栏目】渔业科学进展
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