【摘要】【目的】人工构建一段随机序列并作为扩增内标（Internal amplification control， IAC）添加进实时荧光PCR体系中，建立含有扩增内标的十字花科细菌性黑斑病菌(Pseudomonas syringae pv. maculicola )和油菜茎基溃疡病菌(Leptosphaeria maculans)的多重实时荧光PCR方法，检测上述2种检疫性病菌，旨在在提高检测通量的同时，指示PCR假阴性问题。【方法】通过对实时荧光PCR体系中各个引物及探针比例进行优化，从特异性、灵敏度以及实际样品检测等多个方面对该方法进行系统评价。【结果】在20 μL体系中加入1.114×10~(3)拷贝的IAC不影响靶目标的扩增，特异性强，对十字花科细菌性黑斑病菌及油菜茎基溃疡病菌的灵敏度分别为6.9×10~(-4)、1.6×10~(-4 )ng/μL。应用该方法对52批进口油菜籽和十字花科蔬菜种子样品进行检测，结果显示可以实现上述2种检疫性病菌的快速检测，同时有效指示PCR反应的假阴性。【结论】两种检疫性病菌含IAC多重实时荧光PCR检测方法不仅能提高检测准确性而且能防止漏检，在口岸进口种子检疫中具有推广应用前景， 对引种安全具有重要意义。