【摘要】为了提高牛呼吸疾病综合征多病原混合感染的临床诊断效率，以牛支原体（Mycoplasma bovis,M.b）oppD/F基因、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,P.m）ompH基因、溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica,M.h）gcp基因、牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV）gB基因、牛呼吸道合胞体病毒（bovine respiratory syncytial virus,BRSV）以及牛副流感病毒（bovine parainfluenza virus type,BPIV） 3型a和c基因型（BPIV-3a,-3c）的N基因等为检测靶标，分别设计特异性引物和Taqman探针，通过优化反应条件，采用3管7联的组合方式建立了7种病原体的多联实时荧光定量PCR检测方法。结果显示，该方法仅对本试验的7种病原有特异性反应，与其他常见病原无交叉反应。对M.b、P.m、M.h、IBRV、BRSV、BPIV-3a和BPIV-3c质粒标准品的最低检测限分别为10~2、10~2、10~1、10~2、10~2、10~2和10~1拷贝/μL。组内变异系数小于2.5%，组间变异系数小于5.5%。平行应用该方法和常规PCR方法对临床采集的115份有呼吸道症状牛的鼻拭子进行检测，P.m阳性率36.65%,M.b阳性率27.83%,M.h阳性率25.22%,IBRV阳性率11.30%,BPIV-3c阳性率8.57%,BRSV阳性率0.95%；其中混合感染率为26.1%。共检测到11种混合感染模式，主要由M.b与其他病原体的混合感染，占72.7%(8/11);M.b/P.m混合感染的检出率最高，占60%(18/30);M.b、P.m、M.h在混合感染中出现率排前三，其占比分别为73.3%(22/30)、73.3%(22/30)和43.3%(13/30)；其次为IBRV，占26.7%(8/30); BPIV-3c占13.3%(4/30)。以上结果表明，该方法具有较高的分析敏感性和特异性，可用于牛呼吸疾病综合征多病原感染的联合检测。