【摘要】传统数字全息显微自聚焦技术通过判定关键函数的峰值或谷值确定焦平面，但其峰/谷值附近的灵敏度较低，增加了确定最佳聚焦位置的难度。该文提出了一种频谱分值差动的数字全息显微自聚焦方法，该方法首先将两个虚拟探测器以同等距离分别放置在真实探测器两侧，接着利用频谱分值函数分别得到两条普通聚焦曲线和一条频谱分值差动（DSS）曲线，最后通过搜索DSS曲线的过零点自动识别焦平面。该文以USAF相位板、海拉细胞和血液涂片为实验样本以验证所提方法的有效性，结果表明，与传统方法相比，该方法具有良好的适用性和计算效率。