【摘要】为研究绵羊大肠杆菌性乳腺炎中乳腺成纤维细胞的损伤情况及TLR4的作用机制，通过体外培养获得原代绵羊乳腺成纤维细胞，大肠杆菌人工感染细胞建立大肠杆菌性乳腺炎细胞模型，分析大肠杆菌对细胞损伤的影响及TLR4在大肠杆菌性乳腺炎中的作用。采用酶消化法结合差速消化法获得原代绵羊乳腺成纤维细胞；MTT法检测细胞活力及TLR4阻断剂CLI-095的细胞毒性作用；乳酸脱氢酶法检测大肠杆菌对绵羊乳腺成纤维细胞的损伤情况并筛选最适MOI比值；qRT-PCR法检测caspase-3、TLR4的mRNA相对表达量及CLI-095的阻断效果；比色法检测细胞焦亡蛋白caspase-4,5的酶活性；WB检测TLR4蛋白的相对表达量；平板活菌计数法检测CLI-095对大肠杆菌黏附绵羊乳腺成纤维细胞的影响。分离获得绵羊乳腺成纤维细胞，MTT测定结果显示，细胞活力良好；大肠杆菌以最适MOI=4∶1感染绵羊乳腺成纤维细胞后，各时间段LDH释放量均显著升高；caspase-3 mRNA的相对表达量在感染1～3 h内显著上升，3 h后表达量显著下降；caspase-4,5酶活性在感染1～3 h内升高，3 h后降低。TLR4的mRNA及蛋白表达量均显著上调，CLI-095可抑制大肠杆菌对细胞的黏附作用。大肠杆菌感染成纤维细胞后LDH释放量增加、caspase-3基因表达上调、caspase-4,5酶活性升高，促进了绵羊乳腺成纤维细胞的损伤、凋亡及焦亡；大肠杆菌感染促进绵羊乳腺成纤维细胞内TLR4 mRNA及蛋白的表达；TLR4阻断剂CLI-095可能通过抑制TLR4的表达抑制E.coli对细胞的黏附作用。